pH 对卤虫(Artemia saline)幼体急性毒性初步研究

■ 蒋 湘 林文蔚 许乐乐 梁金荣 叶海琴 陈道海 王锂韫*

（1.岭南师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048；2.广东省粤西海鲜资源可持续利用工程技术研究中心，广东湛江 524048）

卤虫（Artemia salina）是鱼、虾、蟹苗种培育过程 中广泛使用的一种高蛋白活性饵料，也是水生毒理学常用的实验动物，卤虫卵与卤虫具有很高的经济价值与科研价值[1]。我国卤虫天然资源丰富，主要分布在渤海湾盐田及西北部的青海、新疆、西藏等高原和盐湖地区，但其应用开发起步晚，直到20世纪80年代中期开始卤虫的增、养殖试验，国内卤虫养殖采用室外滩涂、盐田盐湖等大面积粗放型养殖模式，受天气等影响较大，产量低且不稳定，卤虫资源不能满足日益增长的水产养殖业的需求[2-3]。因此卤虫的养殖需由捕捞向养殖、粗放养殖模式向工厂化养殖模式转变[4]。罗国芝等[5]利用循环水系统中过滤的固体废弃物培养成生物絮凝液用于卤虫的养殖与营养强化研究。王振华等[6]、刘文御[7]研究表明在循环水养殖系统中pH会因为养殖动物所排放的CO2以及附着池底滤料上硝化细菌的硝化反应而导致水质酸化，pH 降低。低至一定程度的pH 会对水生动物生长发育产生不利的影响。研究卤虫幼体对低pH 的耐受性对开展循环水工厂化养殖有一定的指导价值。

pH 是水产养殖中很关键的一个水质参数，直接对水生动物的代谢机能产生影响。陶易凡等[8]研究表明pH 胁迫影响甲壳动物的肝胰腺正常分泌与代谢活动，引起肝胰腺功能紊乱；间接对水体中氨氮、亚硝酸盐以及Zn2+、Cd2+等的毒性产生显著影响[9-11]，国内外学者开展关于pH 胁迫对凡纳缤对虾（Litopenaeusvannamei）死亡率与抗氧化酶基因表达[12-13]、pH 对巴西境内两种虾的幼体生长和发育的亚致死效应[14]、凡纳缤对虾（Litopenaeusvannamei）的免疫因子[15]等研究。从水生动物毒理学方向，以pH 为主要环境因子对水生动物的急性毒性研究的报告主要集中在对虾类。梁彩凤等[16]通过静水试验法研究低pH 对日本囊对虾（M.japonicas）的急性毒性，分析48、72、96 h半致死pH与pH 4.1、4.4、4.7 的半致死时间；杨富亿等[17]研究日本沼虾（Macrobrachiumnipponense）幼虾对碱度和pH的适应性，计算不同时间的半致死pH 与安全pH；么宗利等[18]采用静态急性毒理学方法，研究碳酸盐碱度和pH 对凡纳滨对虾（L.vannamei）仔虾存活率的影响；王志飞等[19]、白秀娟等[20]等通过急性毒性方法研究pH对秀丽高原鳅（Triplophysa venusta）与文昌鱼（Branchiostomabelcheri）幼鱼急性毒性效应；而关于pH 对卤虫幼体的急性毒性研究鲜有报道，仅见潘正军[21]、杨承忠等[22]关于pH 对卤虫卵孵化率的影响，Blust 等[23]研究的在不同pH 条件下卤虫对铜离子的生物利用率的研究；马婷等[24-25]研究pH 对卤虫无节幼体生长，体脂肪酸，抗氧化指标的影响等。本研究以孵后72 h的卤虫无节幼体为研究对象，通过半静水毒性试验法开展不同pH 梯度的急性毒性与同一pH 下的毒性时间研究，估算安全pH 及95%置信区间和半致死毒性时间，为循环水养殖条件下水质酸化对卤虫养殖及低pH 的耐受性研究和其他海水增养殖过程中的水质管理提供相关参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与方法

实验所用卤虫休眠卵为湛江海神生物科技发展有限公司提供，经实验观察确定为孤雌生殖卤虫（Artemia parthenogeneticaof Tianjin），称取卤虫休眠卵1 g 于5 000 mL烧杯中，加入经处理后循环的海水2 000 mL，全程充氧于2 000 lx 光强度下孵化28 h，调节氧量至卤虫卵浮于水中即可，实验开始前检测循环水的理化因子：pH7.8、溶解氧7.99 mg/L、温度26.7 ℃、盐度26.9、亚硝酸盐4.70 μg/L、氨氮5.94 mg/L。实验所用无节幼体为孵化后72 h 的卤虫幼体。实验容器为直径11 cm、高3 cm 圆柱形食品级塑料容器，有效水体200 mL。实验开始前配置0.1mol/L HCl 溶液 与0.1 mol/L NaOH 溶液 各1 000 mL，通 过pH 计(台湾衡欣pH 测试笔AZ8693）检测海水pH。pH 调节方法：取1 000 mL 新鲜海水，计算出大约所需HCI溶液体积，通过往水中滴加HCl 溶液降低pH，边加边搅拌，当接近所需pH 附近时，逐渐减少滴加量，直到pH 变化值不超过0.1，调节完成。实验过程中不充气，可适当少量投喂饵料，包括虾片、螺旋藻混合液，每隔一定时间检测溶液pH，并换新鲜的实验液保持pH 稳定。

1.2 实验设计

预实验按水生动物毒理学试验方法开展[26-27]，通过查阅文献资料设置pH 分别为3、4、5、6、7、8，共6 个实验组，每个梯度2个重复组，每组放卤虫幼体30只，进行48 h急性毒性实验，找到卤虫的24 h全死亡最高pH 和48 h 全存活最低pH。死亡卤虫幼体判断标准为：幼体沉于底部，碰触附肢10 s不动。

正式实验：根据预实验结果设置pH 分别为4、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、8.0，共7 个实验组，其中pH8.0 为对照组，每个实验组设置3 个重复组，每个实验组随机挑选活力正常的卤虫幼体30 只进行实验，于实验开始后6、12、24、48 h观察幼虫的活动状态，统计死亡幼体数量并用吸管吸出死亡幼体，统计所有实验组的死亡数量平均值。在开展不同pH 对卤虫急性毒性实验同时，对pH 为4.8、5.2、5.6、6.0 的实验组开展半致死毒性时间的实验，观察卤虫在4 种不同低pH 溶液中的耐受性，实验持续时间为192 h，每天记录实验组的存活情况，检测溶液的pH，更换新鲜等pH 的海水，并滴加适当饵料混合液，吸出死亡个体做好记录。

1.3 数据分析

用SPSS 21.0 软件处理数据，Probit 回归法建立概率单位-pH 或实验时间的回归方程，对回归参数检验采用Z-Test，通过Pearson's chi-squared test 检验回归方程的拟合效果，绘制出pH 与概率单位的散点图并添加回归直线，以估算半致死pH、半致死毒性时间及95%置信区间，实验中对照组出现死亡的数据校正方法根据公式校正[27]。

式中：p'——观察死亡百分数；

c——对照死亡百分数；p——校正后的死亡百分数。

2 结果与分析

2.1 pH对卤虫毒性实验结果

由图1 所示，实验范围内随着pH 升高死亡数量减少。结果得到：pH4.0、4.4 实验组在6 h 绝大部分个体死亡，pH4.8及以上的组大部分个体游动正常；24 h时pH4.8、5.2 大部分平行组个体活力较差，表现为游动速率变小，附肢摆动频率减慢，部分个体沉在容器底部摆动附肢直至死亡，死亡个体体色较深；pH5.6、6.0 有少量死亡个体；48 h 时，pH5.6、6.0 死亡数量增加但并未过半，通过对24 h与48 h死亡个体数量进行配对样本t检验发现2 个时间点的死亡数量有极显著差异（P＜0.01），对照组pH8.0 有1 个死亡个体；pH4.8～6.0实验组的半致死毒性时间研究结果如图2所示，相同pH 下，随着毒性时间延长死亡数量增加，死亡速率前期快后期慢，从死亡数据得出pH4.8、5.2全死亡时间分别为96、120 h；pH5.6、6.0 过半死亡时间分别为96、120 h，直到192 h时的死亡数量分别为：（28.00±1.00）、（22.67±3.51）个。GLM 分析结果得到pH 与实验时间及其交互效应对死亡数量均有极显著影响（P＜0.01）。

图1 不同pH值对卤虫幼体的毒性实验结果

图2 急性毒性实验时间对卤虫死亡数量影响

2.2 死亡率随pH变化的拟合曲线

由图3 所示，线1、2 为24 h 观测与期望死亡率，线3、4 为48 h 观测与期望死亡率曲线，拟合曲线随浓度变化先呈逐渐递减趋势而后平稳，近似反S 曲线，Probit 非线性回归通过利用累积标准正态分布函数来拟合浓度对数-死亡率变化，24、48 h 的观测值与期望值曲线相互交错，一致延伸，说明拟合效果较好。24、48 h 期望值与观测值的卡方检验结果分别为：x24h2=8.918，x48h2=1.632；P=0.112，P=0.897，期望值与观测值无统计学上显著差异。利用概率单位Probit 转换，将期望概率（0，1）值转换为在实数范围概率单位值，由此得到概率单位值-浓度对数回归曲线，估算pH 对卤虫无节幼体的24、48 h 的半致死浓度。

图3 死亡率随pH暴露浓度变化的拟合曲线

2.3 概率单位回归分析结果

pH 对卤虫急性毒性及半致死毒性时间的概率单位法分析结果如表1、表2、表3 所示，从表1 中得到不同pH 与不同实验时间的回归直线及其参数估计值、参数估计标准误、参数显著性检验、95%置信区间等。所有参数检验均达到极显著性水平（P＜0.01）。表2中显示pH 与实验时间的概率回归拟合度卡方检验表，卡方值均大于0.05，表明回归直线能较好的拟合实验数据，观测值与期望值差异控制在可接受的范围内，回归方程可信度高。pH 的半致死量估计值与置信区间如表3 所示，24、48 h 的半致死pH 及95%置信区间分别为：5.031（4.791～5.261）、5.345（5.227～5.467），安全pH 为6.50；对应H+摩尔浓度分别为：9.311×10-6、4.519×10-6、3.192×10-7mol/L。在pH 不低于6.50 的水体中养殖卤虫是最低的水质标准。不同pH 条件下的半致死时间分析结果得到：pH4.8 的半致死时间为22.275（14.286～28.928） h、pH5.2 的 半 致 死 时 间 为44.986（33.079～55.288） h、pH5.6 的 半 致 死 时 间 为89.813（79.244～100.231） h、pH6.0 的半致死时间为131.971（119.987～145.860） h。

表1 不同pH与实验时间的概率单位回归参数及置信区间估计

表2 pH与实验时间的概率回归拟合度卡方检验

表3 半致死量估计值与置信区间

3 讨论

3.1 低pH对卤虫幼体生长与发育的影响

pH 是水产养殖中的一个关键的水质参数，通常认为水产养殖的适宜水体为弱碱性水质，过低的pH会直接影响到养殖动物生长发育与繁殖，甚至引起大量死亡[28]。Blust等[23]在研究不同pH 条件下卤虫对铜离子的生物利用率，设置2 个的pH 范围分别为5.37～6.62、6.78～8.34，结果得到5.37～6.62 的实验组卤虫对铜离子利用率显著低于6.78～8.34 的实验组；生长方面的实验表明，低pH 会影响到卤虫对铜离子的生物利用率。潘正军等[21]研究pH6.0～10.0 范围内对西藏大红卵孵化率的影响，结果得到pH6.0 的实验组孵化率显著低于pH8.0孵化率的影响，pH7.0与pH8.0的孵化率无显著差异；Sui等[29]研究4个pH 水平（5、6、7、8）对渤海湾卤虫、旧金山卤虫与越南人工培育卤虫三个产地卤虫的孵化率、存活率与繁殖性能的影响，结果得到当pH 为5 时，孵化率显著低于pH8 组，无节幼体48 h 存活率为0，并且3 个品系的卤虫均无法正常繁殖；相同的实验时间pH7、pH8的存活率显著高于pH6组；杨承忠等[22]以巴里坤湖卤虫为研究对象，结果表明pH5 组不能孵化，pH6 组无节幼体存活率显著低pH7、pH8 组。本研究结果得到24、48 h 半致死pH 分别为5.031、5.345，安全pH 为6.50，与Blust 等[23]研究所确定适宜与非适宜pH 范围基本上相符，在高于pH6.5（pH6.78～8.34）的海水中，更有利于卤虫对铜离子的生物利用；Bsua 等[30]研究证实在pH6.3 以下的海水中卤虫卵的呼吸受抑制进入无氧休眠状态，潘正军等[21]、杨承忠等[22]与Sui 等[29]研究得到低于pH6 实验组的孵化率显著降低或不能孵化。杨承忠等[22]、Sui 等[29]研究都得到pH7、8 组的存活率显著高于pH6组，林小涛等[31]研究证明：当水体pH 低于或高于某一范围时，甲壳动物的呼吸运动受抑制，耗氧率降低。所以在低于pH6.5 的海水中，卤虫幼体会受到pH 的毒性作用导致呼吸受抑制，存活率偏低，这与本研究的结论基本一致。

3.2 卤虫幼体对低pH的耐受性及半致死时间

Han 等[32]研究表明，低pH 会破坏水生动物体内血液酸碱平衡，从而导致有效载氧量减少，引起缺氧，尤其明显减缓甲壳类动物的矿化作用。从水生动物毒理学方向开展pH 对卤虫毒性研究报告较少，但对其它种类的甲壳动物如对虾的研究较多。梁彩凤等[16]研究pH 对日本囊对虾（M.japonicus）急性毒性，得到安全pH 为5.435；陶易凡等[8]研究得到克氏原螯虾（Procambarusclarkii）的安全pH 为4.675；杨富亿等[17]通过急性毒性法得到日本沼虾幼虾的安全pH 范围为5.26～8.67；Furtado 等[33]得到凡纳缤对虾（L.vannamei）对虾幼体的安全pH 为5.04；于天基等[34]研究脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）的安全pH为5.78。而本研究得到卤虫幼体的安全pH 为6.50，高于以上所有研究得到的安全pH，卤虫对低pH 的耐受性明显低于对虾类，猜测这是卤虫与对虾的生理结构复杂程度及逆境调控机制差异导致。我国海水渔业水质标准GB 11607—1989 所规定的pH 指标7.0～8.5，因此卤虫幼体对低pH 敏感性对循环水条件下卤虫养殖及水质管理提供一定的参考价值。

半致死时间是研究水生动物在极端环境因子中耐受程度的一个关键指标[35]。梁彩凤等[16]研究得到日本囊对虾在pH4.1、4.4、4.7 条件下的半致死时间分别为58.281、93.771、139.549 h；李春涛等[36]研究pH 对离体新棘衣棘头虫（Neosentiscelatus）的毒性，在pH4、5、6、7、8 条件下的半致死时间分别为4.2、18.5、3.8、2.8、2.1 h；高焕等[37]研究逆境环境条件对三疣梭子蟹幼蟹(Portunustrituberculatus)致死效应，设置pH6.0、6.5、9.0、9.5，结果表明幼蟹的半致死时间为0.09～15 h，碱性条件下存活时间要长于酸性条件下，以上研究可以反映水生动物对不同pH 的耐受性，尚未见到关于pH 对卤虫的半致死时间的研究报道，本研究得到pH4.8、5.2、5.6、6.0 下的半致死时间分别为22.275、44.986、89.813、131.971 h，从半致死时间可以推出卤虫对低pH 耐受性要低于日本囊对虾，高于新棘衣棘头虫、三疣梭子蟹幼蟹，随着pH 的升高，半致死时间逐渐变长，pH 对卤虫幼体的毒性在减弱。本研究为开展卤虫耐低pH 品系选择及亚甲壳动物的抗逆性研究提供参考数据与方法。另外统计分析发现不同pH下的24、48 h 的死亡数量有显著差异，但是GLM 分析得到在实验后期144、168、192 h三个时间点的死亡数量无显著差异，实验过程中更换试剂液以保持pH 稳定，猜测pH的毒性效应集中前48 h内，而在实验后期卤虫对pH 产生了一定的适应性，因而死亡速率变慢，其应对的调节机制尚不清楚有待进一步研究。