益生菌研究进展及其在宠物食品加工中的应用现状

■ 张赛赛

（上海宠济生物科技有限公司，上海 200082）

伴侣动物已成为社会中非常重要的成员，如犬在过去两个世纪里的社会角色已经从主要劳力（即监护、运输、放牧和狩猎）演变为能够胜任包括特殊行动（如救援、军事）、治疗护理（如疾病检测、帮助感官受损者）和陪伴等工作的一系列角色[1]。考虑到它们在人类生活中的地位越来越重要，对于伴侣动物粮食的关注点也从能否提高其生产力转变为能否改善其健康、寿命和生活质量。这种转变直接体现在功能粮的出现，功能粮作为一种新兴产品，除提供必需的营养素外，更重要的是能够促进机体健康[2]。功能粮的有效成分包括植物提取物、纤维、关节补充剂、非必需营养素或微生物和酵母衍生产品，可通过发挥预防或治疗作用来提高宠物食品的价值[3]。益生菌几个世纪以来一直用于人类食品发酵生产，如酸奶、奶酪、葡萄酒和面包等，近些年被视为健康食品的促进补充剂[4]。但益生菌对宠物的功效是一个相对较新的研究领域，文章对益生菌在宠物食品中的应用进行了综述并展望了潜在发展方向。

1 益生菌

益生菌是指对人类或动物有益的一类活性微生物[5]，主要包括细菌和酵母等。对于动物而言，益生菌通常具有提高其生产性能[6-7]以及抗病力[8]的作用，同时也具有一定的替代抗生素的潜力。益生菌是活的微生物，当给予足够的量时，会给宿主健康带来益处[9]，据估测，2020—2027年间益生菌强化食品市场预计将从480亿美元增长到940亿美元，复合年增长率为7.9%。然而相对于人类和畜禽，益生菌在猫和犬上的应用研究仍较为缺乏。PubMed数据库中1990—2021年间以“人类”和“益生菌”为关键词搜索中相关出版物超过20 000篇，而以“犬”和“益生菌”为关键词仅搜索到相关出版物仅有约250 篇。尽管研究较少，但益生菌在宠物补充剂、食品和零食中得到快速的推广应用，并且已经通过了部分临床实践[10-13]。美国食品和药物管理局兽医中心与美国饲料控制官员协会（AAFCO）于1989 年首次发布了可用于猪和家禽等动物饲料的细菌和酵母生物清单，经过多年的修订，目前有41 种非产毒细菌被认为可安全应用于伴侣动物食品中[14]。我国农业农村部允许使用的饲料微生物添加剂的菌种有34 种，分为乳酸菌类、芽孢杆菌类、酵母菌类和光合细菌类等[15]。这些微生物可以根据生理特征如细胞壁结构、耐氧性以及是否形成孢子来进行分类。

2 益生菌菌株选择标准

一般来说，作为候选益生菌不但要满足安全和监管指南要求，还应对胃肠道中两种主要化学应激源（酸、胆汁盐）具有一定程度的抵抗力[16-18]。此外，任何用于商业加工宠物食品的菌株都应该在温度等外部条件发生变化或和食品本身化学成分（即基质酸度、氧气存在、水活性或存在微生物抑制剂[19]）发生变化时表现出较高的耐受性。宠物食品中添加益生菌与传统宠物食物相比可以提高产品的感知价值[20]，但如果在选择益生菌时没有考虑上述特征，实际应用效果难以保证。研究人员通过对市面上的宠物食品调查研究发现，53%的抽样商业产品标签上的菌株分类和菌落形成单位保证值方面存在严重不足[21]，这表明需要对益生菌菌株活性进行验证，以确保动物食用时菌株的活性。

益生菌的代谢活动具有菌株特异性，同一细菌的不同菌种或菌株并非都具有相同的代谢途径[22]。肠球菌、乳杆菌和双歧杆菌是动物最常用的益生菌，它们的主要终产物为乳酸。传统意义上产乳酸菌株是革兰氏阳性厌氧菌或兼性厌氧菌且不形成孢子[23]，但这些菌株会产生其他物质，例如过氧化氢和细菌素，这些物质会影响宿主微生物群[24]。近期报道中系统评价了上述益生菌对犬的健康益处，包括改善粪便质量和对表观全消化道消化率、微生物发酵终产物以及免疫系统反应的综合影响[25-27]。然而，可应用于食品中的营养细胞（正常生活的细菌细胞）较易因烹饪和在胃肠道环境等压力而受损和死亡，因此需要使用例如微囊化等细胞保护技术等来增强这些微生物的存活率[28]。这是一个不断发展的研究领域，对于含有非孢子形成益生菌的功能性食品的未来至关重要。

3 宠物食品加工工艺对益生菌的影响

绝大多数宠物食品都需经过一定程度的烹饪或灭菌，以达到延长保质期并降低病原微生物等在成品中持久存在的风险的目的。热处理可减少或破坏有害微生物活性，但如果处理不当，加热过程也可能对益生菌造成破坏，导致其细胞外膜和肽聚糖壁、细胞质膜完整性的丧失以及细胞器、RNA、DNA 和酶的变性[29]，选用适当的加工方法尤为重要。

3.1 挤压

挤压是当今宠物食品商业生产中使用最广泛的技术，研究表明在挤压过程中施加到食物的热能与机械能的比率会影响宠物食品颗粒的结构特征[30-31]。嗜热微生物如芽孢杆菌菌种由于具有较高的耐热性，可根据其数量变化来判断加工工艺能否实现灭菌作用，因此该菌种被普遍应用于工艺验证研究[32]。Okelo等[32]研究中将挤压机机筒出口温度、糖浆进料水分含量和机筒停留时间等因素组合在一起形成了15 种工艺组合，结果表明当饲料在24.5%水分含量、3 s 停留时间和82 ℃或更高模具温度挤压时沙门氏菌无存活，嗜热芽孢杆菌仍有存活，证明了形成孢子的微生物在挤压过程中具有存活下来的潜力。

3.2 蒸煮烹饪

大多数宠物食品的蒸煮烹饪过程需要在低酸高水分条件下注入蒸汽，使产品加热至121 ℃以上，目的是消除营养性病原体和腐败微生物以及肉毒杆菌孢子，最终使产品实现无菌。根据食品成分和包装类型，在3～10 min 的升温期间将杀菌锅升温，并于121 ℃下保持至少2 min，如果这种病原体恰好存在于原材料基质中，则保持时间必须足够长以实现孢子数量的减少。烹饪过程的严苛条件使得最顽强的微生物也难以存活，但包括益生元和后生元等在内的功能性成分可能会被保留。

3.3 冷冻干燥

冷冻干燥被认为是一种相对温和的脱水过程，冷冻干燥过程没有外部热量并且使用冷冻干燥法去除水的速度很慢。随着市场对具有高生物利用度和较少热处理的产品的需求不断增加，冷冻干燥的宠物食品和零食在过去十年中受到市场欢迎。由于产品在没有外部热量的情况下脱水，因此冷冻干燥不被视为烹饪过程，但根据产品的设计，冻干宠物食品配方中使用的成分可以是预煮的或生的。宠物食品中使用的许多益生菌制剂最初都是借助保护性介质通过冷冻干燥来保存的，这种保护性介质有助于防止细胞膜和蛋白质因细胞核中流失水分而受损，从而延长了益生菌培养物的货架期。益生菌脱水后由于其细胞含水量已经很低，冻干过程中除去的水分主要来自细胞外周而非细胞内，因此比未脱水的益生菌更适合与粮食混合后进行冷冻干燥。对于未脱水的营养细胞，冻干过程会使细胞内形成冰晶，造成细胞膜结构的破坏，从而损伤细胞[33]。革兰氏阴性菌的细胞壁内存在较薄的肽聚糖层和脂多糖，因此革兰氏阴性菌相对于革兰氏阳性菌株的存活率较低[34]。然而，冷冻干燥对活细胞的破坏作用不足以减轻食源性病原体的风险，因此许多冻干宠物食品和零食可能会经过独立于冻干循环的辐照或高压处理等对其进行额外加工。

3.4 烘焙

烘焙在面包、零食、蛋糕、玉米饼、糕点、馅饼、宠物零食、宠物食品等产品加工过程中应用广泛。传统的烘焙产品主要由谷物粉组成，但基于肉类配方的烘焙产品在宠物食品行业也较为常见。烘焙过程中活微生物遇到的主要压力源是热量，烘焙持续的时间和温度足以灭活大肠杆菌或沙门氏菌病原体，但目前尚未有针对不同烘焙过程中病原菌或直接可饲喂微生物灭活效果的科学验证。有试验表明，在190.6 ℃条件下经过17 min的烘焙，肠道沙门氏菌亚种由8 log CFU/g减少至3 log CFU/g，而烘焙21 min才能减少至1.9 log CFU/g[35]；在传统烤箱中烘焙13 min 的汉堡面包需要高达218.3 ℃才能达到减少至2 log CFU/g[36]。这表明微生物存活率的可变性可能取决于烘焙温度和时间以及微生物固有的耐热特性。为了规避热应激，将益生菌细胞包裹在烘焙产品表面的可食用薄膜或涂层中是一种具有发展前景的方法，在以海藻酸钠为底物的成膜溶液中，浓缩乳清蛋白可将益生菌悬浮在上述凝胶中，用作烘焙食品的局部涂层。由94%的水、5%的淀粉和1%的微胶囊化益生菌组成的功能性淀粉基涂层应用于面包并于180 ℃下烘焙16 min 后，微胶囊化嗜酸乳杆菌的存活率达到63%[37]。研究表明，植物乳杆菌（CIDCA83114 菌株）在30 ℃烘焙40 min 后，使用玉米淀粉基薄膜（活细胞计数减少4 个对数）比海藻酸钠薄膜（活细胞计数减少6 个对数）提高了存活率[38]，这表明基于淀粉的悬浮液可能比其他薄膜更有效地保护烘焙条件下的益生菌活性。考虑到微生物制备、宠物食品和治疗配方中使用的原材料、应用方式和加工条件等各个环节涉及的范围较广，有必要将益生菌活性验证作为商业化标准流程的一部分。

4 益生菌在伴侣动物中的功效研究现状

猫和犬的消化系统相对简单，适合消化高蛋白质的食物。相对于犬，猫是相对严格的食肉动物，对葡萄糖等碳水化合物利用率低，对高蛋白质食物的要求更高[39]；虽然犬与猫有许多相同的解剖学和代谢特征，但犬更偏向于杂食，可消化、吸收和代谢大量碳水化合物[40]。由于猫和犬具有不同的饮食需求和消化系统，它们对益生菌的需求以及益生菌产生的效果也不同。

4.1 犬用益生菌

胃肠道疾病是犬类最常见的健康问题之一[41]，大多数表现为急性或慢性腹泻，在某些情况下表现为呕吐或厌食[42]。已有研究表明不同类型的益生菌对于治疗犬的肠道疾病具有积极结果[43]。目前在犬上研究应用较多的益生菌包括乳杆菌属（Lactobacillus）和肠球菌属（Enterococcus）。例如，饲喂犬源约氏乳杆菌（L.johnsoniiCPN23）能够降低雌犬血浆葡萄糖和胆固醇水平，并增加高密度脂蛋白和低密度脂蛋白比率[44]，同时增加提高其纤维消化率，增加粪便短链脂肪酸浓度、降低氨浓度[45]；饲喂犬源发酵乳杆菌（L.fermentumCCM 7421）能够提高犬只粪便乳酸菌数量、降低梭菌数量，改善血液中的总蛋白质、胆固醇和丙氨酸转氨酶水平[46]；此外，饲喂鼠乳杆菌（L.murinusLbP2）[47]或嗜酸乳杆菌（L.acidophilusD2/CSL）[48]能够改善犬只体况评分、粪便稠度、精神状态及食欲。肠球菌研究方面，饲喂屎肠球菌（E.faeciumDSM 32820）犬只在整个试验过程中具有最佳的粪便稠度，刺激了血液吞噬细菌活性和白细胞代谢活性[49]；饲喂屎肠球菌（E.faeciumSF68）能够改善犬只腹泻症状并消除贾第鞭毛虫包囊[50]，同时提高三酰甘油浓度并降低胆固醇浓度[51]。除上述两类益生菌之外，也有研究发现饲喂双歧杆菌（Bifidobacterium animalisBb12）的犬只粪便中三酰甘油和白蛋白浓度显著降低，乙酸、乙酰乙酸和戊酸浓度增加[52]。益生菌之间也可能存在协同作用，例如，同时饲喂犬只乳杆菌（L.caseiZhang 和L.plantarumP-8）和双歧杆菌（B.animalissubsp.lactisV9）能够显著提高其平均日采食量和平均日增重，增加粪便中的有益细菌并减少潜在有害细菌数量[53]。

4.2 猫用益生菌

与犬相比，益生菌在猫中使用的研究较少，而且由于生理特征和日粮组成的差异，益生菌对猫生长和健康的作用功效无法完全从犬的研究结果中推断[54]。与犬相似的是，在猫上研究应用的益生菌主要也是乳杆菌属和肠球菌属，其中屎肠球菌SF68 对猫的益生作用研究较多：幼猫阶段，屎肠球菌SF68 能够通过提高CD4+淋巴细胞比例改善其免疫力[55]；在成年猫阶段，屎肠球菌SF68 能够缓解其腹泻发生率[56-57]，同时使粪便微生物多样性，这表明微生物群更稳定；此外，屎肠球菌SF68 对改善感染慢性猫科动物疱疹病毒1的猫肠道微生物群落稳定性，并降低了与该病毒感染相关的发病率[58]。除屎肠球菌外，添加另一种肠球菌属的益生菌——多毛肠球菌（E.hirae）能够提高该菌在幼猫肠道中的定植水平[59]。乳杆菌属方面，嗜酸乳杆菌DSM13241 可增加成年猫粪便中有益的嗜酸乳杆菌和嗜酸乳杆菌群的数量，并减少梭菌属的数量，降低粪便pH 和血浆内毒素浓度[54]；另一方面，嗜酸乳杆菌D2/CSL 能够改善健康成年猫的粪便形态并增加粪便中的乳杆菌数量[60]。

5 结论

益生菌有助于促进伴侣动物的健康和保健，在实际生产中，益生菌产品主要以饲料添加剂、膳食补充剂和含益生菌食品的形式出现，但在宠物食品加工过程中如何保证益生菌活性、保证产品的功效仍存在许多挑战，因此，选择合适的菌株至关重要。在选择宠物食品生产应用中挑选益生菌菌株要考虑生理特性（尤其是耐热性、耐氧性、耐酸和胆汁性）、稳定方法（如孢子形成、冷冻干燥或封装）、加工条件（包括时间、温度、压力、水分、水分活度、pH）、使用方法、包装和储存条件等，且未来在开发应用新型益生菌菌株或在对加工条件、产品配方或包装设计进行任何调整时均应验证益生菌的活性。