湖北省四湖流域典型抗生素分布特征及生态风险评估

徐春燕,凌海波,张 姝,向罗京,李苇苇,明 德,易 川

(湖北省生态环境科学研究院,湖北 武汉 430072)

抗生素是一种从微生物中提取或由化学方式制成、对各种或特定病原微生物具有强力抑制或杀灭作用的化合物。抗生素在机体内的吸收有限,只有少量抗生素会被吸收,约60%～90%的抗生素以原型形式随排泄物排出体外[1],最终通过各种途径进入环境,对生态系统造成潜在的风险。大量的抗生素和其代谢物进入环境后,可诱导生物体产生抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes,ARGs),从而加速ARGs在环境细菌间的扩散与传播,而抗性微生物在环境中的产生和传播,是影响人类健康的重要风险因素。

自然环境中有200多种抗生素,根据其不同的化学结构及功能,可将其分为10大类,其中磺胺类、四环素类、喹诺酮类、大环内酯类和β-内酰胺类是中国消耗量较大的5大类抗生素[2]。我国是抗生素生产和使用大国,随着美丽中国和健康中国建设的推进,抗生素被公认为典型新污染物以加强管控。近年来,针对我国较大河流、湖泊、入海口等区域抗生素污染状况的研究较多,如珠江[3]、长江[4]、黄河[5]、辽河[5]、环渤海[6]、黄海[7]等水体或沉积物中均被报道存在多种抗生素污染,其污染浓度在ND～3 474 ng/L水平。就湖北省来看,除长江、汉江、东湖、南湖等重要水体外,尚未见其他区域水体中存在抗生素污染的相关报道。鉴于抗生素及其抗性基因对生态系统的危害性,且不同地区环境中抗生素的检出情况受各地区用药习惯的影响显著,不同区域水体中抗生素的污染问题仍应引起关注。同时,相对于水体中抗生素污染的广泛研究,沉积物中抗生素污染状况的研究相对较少。沉积物是水体中污染物迁移转化过程中的重要载体和归宿,进入水体的抗生素类污染物会在底泥中形成蓄积性污染,并在一定情况下从沉积物中重新释放至水体,造成二次污染[8]。因此,除水体外,对沉积物中抗生素的赋存状况展开调查,对于准确把握一个区域环境中抗生素污染状况具有重要意义。

湖北省四湖流域是长江中游一级支流内荆河流域,地处长江、汉水之间,因境内有长湖、三湖、白鹭湖和洪湖四大淡水湖而得名,其中三湖、白鹭湖因自然、人为因素已基本消失,现流域内水体主要为长湖、四湖总干渠、洪湖。四湖流域总面积为11 547.5 km2,现有人口约400万人,是湖北省乃至全国重要的农业种植和水产养殖基地。境内因人口密集,畜禽、水产养殖体量大、分布集中,抗生素使用、排放量大,环境风险高。本研究以四湖流域三大主要水体长湖、四湖总干渠、洪湖为研究对象,探索了四湖流域水体和沉积物两种环境介质中5大类14种抗生素的污染特征,并利用商值法对抗生素的生态风险进行了评估,以期为全国畜禽、水产养殖重点区域环境中抗生素生态风险的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 采样点布设与样品采集

长湖、洪湖两湖泊采样点布设优先考虑国控点,四湖总干渠采样点一般设置于重要支流的交汇处,共设置14个采样点位,其中长湖2个(SH1、SH2)、四湖总干渠8个(SH3—SH10)、洪湖4个(SH11—SH14),采样点分布如图1所示。本研究于2021年7月对湖北省四湖流域水体和表层沉积物样品进行采集,其中水样于水表面0.5 m处取样2 L,置于棕色玻璃瓶中;沉积物采集深度为表层(0～0.2 m),每点位采集不少于1 kg沉积物样品置于棕色玻璃瓶中。沉积物样品采样频次为单次,水样为同一时间点连续采集3 d,共采集样品56份(其中水样42份,沉积物14份,不包括现场平行样6个)。所有样品采集完成后,4 ℃避光保存,48 h内完成前处理。

图1 湖北省四湖流域采样点位分布图Fig.1 Distribution of sampling sites in Four-lake watershed of Hubei Province

图2 湖北省四湖流域水体和沉积物中抗生素浓度空间分布图Fig.2 Spatial distribution of antibiotic concentration levels in water and sediments in Four-lake watershed of Hubei Province

1.2 试验材料与试剂

试验材料:标准品磺胺嘧啶(Sulfadiazine,SDZ,纯度99.19%)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole,SMX,纯度99.56%)、磺胺喹噁啉(Sulfaquinoxaline,SQX,纯度98.92%)、恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR,纯度99.90%)、诺氟沙星(Norfloxacin,NOR,纯度97.29%)、土霉素(Oxytetracycline,OTC,纯度96.02%)、金霉素(Chlortetracycline,CTC,纯度92.5%)、红霉素(Erythromycin,ERY,纯度95.0%)、罗红霉素(Roxithromycin,ROX,纯度96.2%)、泰乐菌素(Tylosin,TYL,纯度92.1%)、阿奇霉素(Azithromycin,AZM,纯度99.0%)、阿莫西林(Amoxicillin,AMX,纯度98.74 %)、青霉素(Penicillin,P,纯度98.8%),均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH;左氧氟沙星(Levofloxacin,LEV,纯度97.3%)购自中国食品药品研究院。

试验试剂:甲醇(LCMS级)、甲醇(色谱纯)和乙腈(色谱纯)购自美国Thermo Fisher公司;甲酸(色谱纯)购自北京百灵威科技有限公司;其他试剂,如氨水、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)、柠檬酸(C5H8O7·H2O)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、硫酸、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯,购自国药集团。试验用水为超纯水。

C18反相色谱柱(100 mm/50 mm×2.1 mm,1.8 μm)购自美国Agilent公司;HLB固相萃取柱(Oasis HLB 6 mL,200 mg/500 mg 和Oasis MAX 6 mL,150 mg)购自美国Waters公司;微孔滤膜混合纤维膜(0.45 μm,φ50 mm)和针式过滤器(0.22 μm,φ13 mm)购自上海新亚净化器件厂。

1.3 试验方法与样品质量控制

1.3.1 样品前处理

水样静置,取上清液经0.45 μm滤膜抽滤后,准确量取水样500 mL经稀硫酸调节pH值至4.0,加入0.15 g Na2EDTA,混匀;预先依次用6 mL甲醇、6 mL水活化HLB固相萃取柱,水样上样速度控制在2.0～5.0 mL/min,上样完成后继续抽干30～60 min;用5 mL甲醇溶液、5 mL 0.1%甲酸甲醇溶液、5 mL甲醇-乙腈混合溶液(V∶V=1∶1)依次洗脱,合并洗脱液;氮吹浓缩至0.5 mL以下,用由甲酸、纯净水、甲醇、乙腈(V∶V∶V∶V=0.02∶2∶4∶4)配置的混合溶液定容至1.0 mL,过0.22 μm滤膜后待上机测试。

称取(2.00±0.05)g沉积物样品,加入10.0 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液,涡旋混匀,再加入10.0 mL乙腈,涡旋混匀;超声提取30 min,取出样品以6 500 r / min转速离心5 min,取上清液500 mL于棕色玻璃瓶中,加入300 mL纯净水,摇匀,HLB固相萃取柱净化;后续步骤同水样。

1.3.2 样品检测

采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法进行样品分析,超高效液相色谱仪为Agilent 1290 Infinity,购自美国Agilent公司;三重四级杆质谱仪为AB 3500 Q Trap,购自美国AB SCIEX公司。色谱条件:柱温35 ℃,进样量5 μL,流速0.30 mL /min;流动相A为0.1% 甲酸-水溶液,流动相B为甲醇-乙腈混合溶液(V∶V=1∶1)。梯度洗脱程序为0.00～1.00 min,5% B;1.00～2.00 min,15%～40% B;2.00～2.60 min,75% B;2.60～4.00 min,90% B;4.00～5.00 min,95% B;5.00～7.00 min,5% B。质谱条件:采用正离子电离模式,电离源为电喷雾电离源ESI(+),离子源温度550 ℃,喷雾电压5 500 V,气帘气35 psi、碰撞气7 psi、雾化气和辅助加热气均为55 psi,扫描方式为多反应监测(MRM)模式。

1.3.3 样品质量保证与质量控制

试验过程中使用的玻璃瓶均在重铬酸钾溶液中浸泡24 h,去离子水和超纯水各润洗3次。采用外标法和离子比定量,结合目标物出峰的保留时间、母离子和子离子(定性离子和定量离子)进行定性。按照磺胺类抗生素线性范围为0.5～20.0 ng/mL、喹诺酮类抗生素线性范围为2.5～100 ng/mL以及四环素类抗生素、大环内酯类抗生素和青霉素类抗生素线性范围为10.0～400 ng/mL配制相应混合标准工作曲线。14种抗生素物质在曲线范围内与其对应的峰面积呈良好的线性关系,线性相关系数R2>0.99。将空白样品(实验室和采样现场)和平行样品进行上机分析,空白样品中抗生素的浓度不超过检出限,分别用3倍信噪比对应的标样浓度来估算仪器的检出限,采用实验室空白样品加入目标化合物试验求取回收率,目标物的加标回收率和检出限见表1。

表1 14种抗生素的加标回收率和检出限

1.4 抗生素生态风险评估

依据欧盟指导文件中相关环境风险评估方法,通过风险商值(RQ)对环境中抗生素残留的生态风险进行评估。假设生态风险评估中抗生素之间不存在“协同”或“拮抗”作用,则RQ为抗生素实测环境浓度(MEC)与预测无效应浓度(PNEC)的比值。由于抗生素类化合物在沉积物中对底栖生物的生物毒性数据缺乏,本研究参考相关研究[9-11],通过将沉积物中抗生素无效应浓度转化为水体浓度,然后通过水生生物毒性效应数据对其生态风险进行评估。具体计算公式如下:

RQwater=MEC/PNECwater

(1)

RQsediment=MEC/PNECsediment

(2)

PNECsediment=PNECwater×Kd

(3)

Kd=Koc×Foc

(4)

lgKow=0.623lgKoc+0.873

(5)

上式中:Kd为沉积物-水分配系数(无量纲);Koc为有机碳分配系数(无量纲);Foc为有机碳质量分数(%),本研究取均值3%;Kow为水比辛醇分配系数(无量纲)。

上述公式可根据具体情况选择使用。根据Hernando等[12]提出的风险商的分类方法,当RQ≥1时,认为抗生素污染使水生态处于高风险状态;当0.1≤RQ<1时,为中等风险;当0.01≤RQ<0.1时,为低风险。

2 结果与讨论

2.1 四湖流域水体和沉积物中抗生素浓度水平分析

2.1.1 水体中抗生素浓度水平分析

在四湖流域水体14个采样点位中,除ERY、ROX、SMX、AZM、ENR、LEV存在不同程度污染外,其他8种抗生素均未被检出,具体如表2所示。

表2 湖北省四湖流域水体中抗生素浓度水平和检出率

由表2可知:

1) 从检出率看,四湖流域水体中已检出6种抗生素的检出率为7%～50%,其中SMX检出率最高,为50%,其次为ROX、AZM、LEV,检出率均为14%,ERY、ENR的检出率最低,为7%。

2) 从检出浓度水平看,水体中检出浓度最高的为SMX,最高检出浓度为42.78 ng/L,其次为AZM、ROX,最高检出浓度分别为35.50、18.58 ng/L,ERY和LEV检出浓度较低,最高检出浓度分别为2.48 ng/L和2.18 ng/L。

3) 总体上看,水体中检出的3大类抗生素浓度水平依次为大环内脂类>磺胺类>喹诺酮类,这与部分研究水体中磺胺类检出浓度最高有差异,这可能与不同区域抗生素使用习惯不同,导致检出种类和浓度存在差异有关[13]。

此外,由表2还可知,四湖流域水体中检测的14种抗生素中,2种四环素类、2种β-内酰胺类抗生素均未被检出,4种大环内脂类抗生素检出3种,3种磺胺类抗生素检出1种,3种喹诺酮类抗生素检出2种,从检出率来看,大环内脂类>喹诺酮类>磺胺类。四环素类和β-内酰胺类抗生素在四湖流域水体中均未被检出是合理的,这是因为该类抗生素在水环境中极易降解[14-15],这与环渤海[6]、湖南东江湖[13]等水体中抗生素污染的研究结果一致。大环内脂类抗生素虽然在环境中易降解[16],但由于该类抗生素在我国消耗量高,因此在环境中其检出率仍较高[6]。本研究水体中喹诺酮类抗生素检出率较高的主要为ENR,LEV仅一个采样点位有检出,Binh等[15]对水产、养殖和医院等不同来源废水中抗生素污染状况的研究也发现,ENR是水产养殖废水中最常见的抗生素种类,本研究水体中ENR的高频率检出可能也与四湖流域水产养殖过程中ENR的高频率使用有关。本研究水体中检测的3种磺胺类抗生素中,仅SMX一种有检出,且其检出浓度较高,最高检出浓度为42.78 ng/L,这也与SMX的使用量及环境行为有关。磺胺类作为典型兽药抗生素在水产养殖、畜禽养殖过程中被广泛使用[6,13],在饲料中加入磺胺类抗生素可有效地预防和抑制畜禽疾病,而SMX主要存在于水环境中,且其稳定性较强,很难通过水解或生物降解的途径将其去除,同时由于SMX使用量较大,因此在水环境中其检出率及检出浓度均较高。

在四湖流域水体每类抗生素中筛选出检出率和浓度水平相对较高的抗生素与国内外其他水体进行了对比分析,见表3。

表3 湖北省四湖流域与其他流域水体中抗生素浓度水平对比

由表3可知:四湖流域水体中SMX浓度水平(ND～42.78 ng/L)显著高于赤水河[17]、汉江[18]、金沙江[19]等流域水体,但低于珠江[20]、渭河[21]、湟水河[22]等流域水体;四湖流域水体中ROX浓度水平高于肇庆星湖[23]水体,但低于山东四大主要河流[24]水体;四湖流域水体中AZM浓度水平高于北京城区河流及湖泊[25]水体、广东潮汕和珠三角主要入海河流[26]水体;与国外其他水体对比,四湖流域水体中SMX平均浓度水平高于德国东北部地区地表水体[14],但低于日本城区主要河流[27]水体和美国废水排放点[28],总体来看,本研究区域水体中检出浓度较高的3种抗生素与国内外其他流域水体相比,为一般污染水平。

2.1.2 沉积物中抗生素含量水平分析

四湖流域沉积物14个采样点位中,除OTC、CTC、ROX、AZM、ENR、LEV有不同含量检出外,其他8种抗生素均未被检出,具体检出情况见表4。

表4 湖北省四湖流域沉积物中抗生素含量水平和检出率

由表4可知:

1) 从检出率看,四湖流域沉积物中已检出抗生素的检出率为7%～43%,其中ENR检出率最高,为43%,其次为OTC、CTC、ROX、LEV,检出率分别为29%、29%、29%、21%,AZM检出率最低,为7%。

2) 从检出含量水平看,沉积物中检出含量最高的为OTC,最高检出含量为61.56 μg/kg,其次为LEV、CTC和AZM,最高检出含量分别为48.12、27.42和11.76 μg/kg,ENR和ROX检出含量相对较低,最高检出含量分别为2.78、2.61 μg/kg。

3) 总体上看,沉积物中检出的3大类抗生素含量水平依次为四环素类>喹诺酮类>大环内脂类。

另外,由表4还可知,四湖流域沉积物中检出的抗生素种类与水体存在较大的差异:水体中未检出的2种四环素类抗生素,在沉积物中均有检出,且检出含量较高;水体中检出率及检出浓度较高的磺胺类抗生素SMX在沉积物中未被检出;ROX、AZM 2种大环内脂类,ENR、LEV 2种喹诺酮类抗生素在水体和沉积物均被检出。四湖流域水体和沉积物中抗生素分布特征的差异,表明抗生素在环境介质中的分布受其环境行为影响。其中,磺胺类抗生素的土壤吸附能力差、迁移能力强,极易迁移至地表水或地下水,因此主要存在于水体中;四环素类抗生素含有羟基、烯醇羟基及羰基等极性官能团,对沉积物具有很强的吸附能力,此外四环素类抗生素的固-液吸附分配系数相对较高,更易吸附于固体颗粒物表面,进入环境后更容易在沉积物中吸附累积[26,29-30],因此其在沉积物中含量往往相对较高。此外,沉积物中OTC、CTC的高含量检出,与其使用量也存在一定的关系,根据《饲料药物添加剂使用规范》,OTC、CTC除了预防和治疗疾病使用外,还可以作为促生长剂添加于饲料中,导致该类抗生素的使用量较高。相对于水体中抗生素污染状况的广泛研究,抗生素在沉积物中分布状况的研究相对较少。刘四光等[31]在闽江河口区调查表明,沉积物中四环素类抗生素未被检出,喹诺酮类和大环内脂类抗生素检出含量水平分别为0.03～15.60、0.02～44.31 ng/g;易启同[1]在九龙江河口研究显示,沉积物中四环素类、喹诺酮类和大环内脂类抗生素含量水平分别为1.30～17.50、0.85～16.60、ND～2.60 ng/g;除河流外,太湖[32]、白洋淀[33]、东湖、沙湖[34]等湖泊沉积物中均有以上3大类抗生素污染的报道,其含量水平均较本研究低,但本研究沉积物中抗生素含量水平低于黄河口、辽河、海河口[5]等入海口沉积物。美国新泽西北部河流沉积物中6种喹诺酮类抗生素含量范围为1～32 ng/g,5种大环内酯类抗生素含量范围为1～44 ng/g,4种四环素类抗生素均未被检出[35]。总体上看,本研究区域沉积物中检出含量高的喹诺酮类、大环内脂类和四环素类抗生素含量水平处于中等偏上水平。

2.2 四湖流域水体和沉积物中抗生素空间分布特征分析

抗生素浓度的空间分布受抗生素的环境行为以及人为生产、生活活动等因素的影响。从空间分布看,水体中抗生素浓度呈现点源扩散形式的分布特征,各采样点位中,除SH4和SH13采样点位水体中总浓度水平较高外,其他点位水体中抗生素浓度水平均一般。通过对比采样点位与周边功能区分布可以发现:SH4采样点位位于四湖总干渠入长江支流上,该点位上游为污水处理厂,主要接纳周边生活污水和规模化养殖场养殖废水;SH13采样点位位于洪湖东北角,为洪湖直排口,此外现场采样发现洪湖东北角处建有鱼场,规模化养殖活动可能导致抗生素在此富集。进一步结合SH4、SH13两采样点位水体中检出的抗生素类别分析发现,两采样点位水体中主要抗生素种类分别为SMX、AZM,水体中最高检出浓度分别为42.78、35.50 ng/L,分别占两采样点位水体中抗生素总浓度的54.39%和75.56%,磺胺类抗生素为典型兽药,AZM可用于人类用药和水产养殖,尽管AZM降解较快,但是由于水产养殖区等区域持续大量使用,仍可导致水体中出现AZM较高的检出浓度[9],表明污水处理厂排放和规模化水产养殖排泄是影响水体中抗生素浓度空间分布特征的主要因素。

由表4可知:四湖流域沉积物中抗生素含量水平的空间分布呈现四湖总干渠高于长湖、洪湖两湖泊沉积物的特征,其中四湖总干渠沉积物中抗生素含量又呈现中间高、两边低的特征。结合周边水系及人为活动分析发现,沉积物中抗生素含量最高的采样点位SH9为福田寺节制闸,位于四湖总干渠中下游,是总干渠所有污染物的汇集地,因此其检出含量较其他沉积物采样点位高;沉积物中抗生素含量次高的采样点位为SH6和SH5,现场采样发现周边为规模化养猪场聚集地(如陈湖养殖场等),提示规模化养殖排泄是影响沉积物中抗生素含量空间分布特征的主要因素。进一步对沉积物各采样点位检出的抗生素类别分析发现,SH9采样点位沉积物中检出含量高的抗生素种类主要为OTC、CTC两种四环素类抗生素和LEV,最大检出含量值分别为78.01 μg/kg和48.12 μg/kg,占该沉积物中采样点位抗生素总含量的比例分别为60.77%和37.49%,SH6、SH5两个采样点位中沉积物抗生素检出种类也主要为四环素类抗生素,OTC、CTC等四环素类抗生素除了预防和治疗疾病使用外,还可以作为促生长剂添加于饲料中,在畜禽养殖中得到了广泛使用,四环素类抗生素虽半衰期短,但在使用频率高、使用量大的情况下, 环境介质中仍可出现较高的赋存含量,研究区域沉积物中四环素类抗生素高含量检出, 再次表明畜禽养殖是影响该区域沉积物中抗生素空间分布特征的主要因素。

2.3 抗生素生态风险评估

由于四湖流域水体和沉积物中大部分抗生素的检出率和检出水平较低,且少数目标抗生素(LEV)急性毒性数据缺失,因此本研究仅对四湖流域水体(SMX、ROX、AZM)和沉积物(OTC、CTC、AZM)中检出率和检出水平较高的剩余5种抗生素进行生态风险评估,相关参数选取和评估结果见表5。

表5 湖北省四湖流域水体和沉积物中5种抗生素的lgKow、PNEC、Kd及RQ值

由表5可知:四湖流域水体中检出率和检出浓度高的抗生素中,SMX具高生态风险,ROX、AZM具中生态风险;沉积物中检出率和检出含量高的抗生素生态风险均在可接受范围内。杨聪等[38]在洪湖的研究显示,洪湖水环境中SMX呈中生态风险,AZM呈高生态风险,OTC、CTC等均呈低生态风险,与本研究结果大体一致,水体中SMX、AZM具体生态风险等级的差异可能与采样时期、调查点位的差异有关;辽宁省清江流域水体中抗生素生态风险评估显示[39],该流域水体中NOR和SMX具高生态风险,OTC和CTC具低生态风险;大连市畜禽养殖周边水体中ROX、SMX污染具高生态风险,四环素类抗生素具低生态风险[40],这与四湖流域水体抗生素总体污染状况较为一致。

3 结论与展望

1) 本研究在湖北省四湖流域水体中检测出3大类6种抗生素,水体中3大类抗生素浓度水平依次为大环内脂类>磺胺类>喹诺酮类,水体中6种抗生素中,SMX浓度最高,其次为AZM和ROX。在四湖流域表层沉积物中检测出3大类6种抗生素,沉积物中3大类抗生素含量水平依次为四环素类>喹诺酮类>大环内脂类,6种抗生素中OTC含量最高,其次为CTC和LEV。与其他地区相比,四湖流域水体中检出浓度高的3大类4种抗生素为一般污染水平,沉积物中检出含量高的四环素类、喹诺酮类和大环内脂类抗生素为中等偏上污染水平。

2) 四湖流域水体中3大类抗生素浓度水平存在一定的差异,四湖总干渠水体中抗生素浓度水平较长湖、洪湖水体高,且呈现河流比湖泊高的空间分布特征。

3) 四湖流域水体和沉积物中抗生素生态风险评估结果表明:水体中SMX具高生态风险,ROX、AZM具中生态风险;沉积物中检出率和检出含量高的抗生素的生态风险均在可接受范围内。

本研究结合研究区域抗生素来源以及我国抗生素使用情况,筛选出5大类14种抗生素为代表开展了四湖流域水体和表层沉积物中抗生素含量水平和空间分布特征的探讨和分析,但研究种类有限,今后还需扩大研究范围,进一步探究更多种类抗生素在水体、大气、土壤、沉积物等多种环境介质中的分布与迁移转化规律,以为养殖重点区域抗生素污染的控制与治理提供更为全面的科学依据。