一测多评法同时测定都梁丸中7 种成分的含量

袁子民，朱春璐，王 静*

（1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.石药集团远大大连制药有限公司，辽宁 大连116021）

都梁丸收载于2020 年版《中国药典》，处方由酒炖白芷和川芎组成，具有祛风散寒、活血通络之功效，临床多用于治疗风寒淤血阻滞脉络所致的头痛[1]。主要含有香豆素类、苯酞类、挥发油类、有机酸类等化学成分，通过改善血液黏度与血流动力学、调节血管舒缩相关因子及抗炎、镇痛等药理作用发挥药效[2-4]。目前，都梁丸的质量标准及文献报道中多以欧前胡素或阿魏酸为含量测定指标[5-7]，缺少有效表征其多指标化学成分的质量控制标准。因此，本研究在对其血清药物化学研究的基础上[8]，采用HPLC 法建立一测多评法同时测定都梁丸中阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白当归素、欧前胡素、洋川芎内酯A、异欧前胡素含量，以期为都梁丸质量标准的提升及其改良型制剂的二次开发提供科学依据。

1 仪器与试药

Agilent1100 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；都梁丸按2020 年版《中国药典》（一部）制法自制（D1-D10）；欧前胡素（批号：110826-200307，纯度≥98%）购于中国食品药品检定研究院；白当归素（批号：P01028SA13，纯度≥98%）、水合氧化前胡素（批号：R25A6F2764，纯度≥98%）、异欧前胡素（批号：ZM0531BB13，纯度≥98%）均购于上海源叶生物科技有限公司，洋川芎内酯A（批号：17051901，纯度≥98%）、洋川芎内酯Ⅰ（批号：17121104，纯度≥98%)、阿魏酸(批号：17092501，纯度≥98%)均购于成都普菲德生物技术有限公司。乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18(5μm，250 mm×4.6 mm)；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱：0 ～ 50 min，5%→65%A； 50 ～ 70 min，65%→95%A；检测波长：300 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样体积：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 分别取10 批都梁丸样品，剪碎，混匀，取约3 g，精密称定，精密加入等量的硅藻土，研匀，取约2 g，精密称定，置容量瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定，超声（250 W，40 kHz）1h，放冷，用70%甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白当归素、洋川芎内酯A、欧前胡素、异欧前胡素对照品适量，置50 mL 容量瓶中，加甲醇制成浓度分别为0.232 mg/mL、0.209 mg/mL、0.136 mg/mL、0.060 mg/mL、0.422 mg/mL、0.160 mg/mL、0.125 mg/mL的对照品溶液，备用。分别精密量取洋川芎内酯Ⅰ、白当归素、欧前胡素、异欧前胡素对照品溶液各1.0 mL、阿魏酸对照品溶液0.5 mL、水合氧化前胡素对照品溶液0.25 mL、洋川芎内酯A 对照品溶液2.0 mL 置10 mL 容量瓶中，加甲醇制成阿魏酸11.600 μg/mL、洋川芎内酯Ⅰ 20.900 μg /mL、水合氧化前胡素3.400 μg/mL、白当归素6.000μg /mL、洋川芎内酯A 84.400 μg/mL、欧前胡素16.000 μg /mL、异欧前胡素12.500 μg/mL 的混合对照品溶液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按照都梁丸处方及制法分别制备不含酒炖白芷、川芎的阴性样品，按“2.2.1”项下方法制备阴性样品溶液，即得。

2.3 阴性干扰试验

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件依法进样测定分析，结果见图1 ～ 4。由图可知，各待测成分与相邻色谱峰能分离较好，相应阴性样品溶液无干扰。

图1 HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系试验 分别精密吸取“2.3”项下混合对照品溶液2.5、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪。以对照品进样量（X，μg）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行回归，得到线性方程，结果见表1，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 线性方程及线性范围Tab.1 Linear equation and linear range

2.4.2 精密度试验 取同一都梁丸供试品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，计算阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白当归素、洋川芎内酯A、欧前胡素、异欧前胡素峰面积的RSD，分别为0.68%、0.88%、0.46%、0.73%、0.76%、0.28%、0.50%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一都梁丸供试品溶液10 μL，于0、2、4、8、10、12 h 在“2.1”项下色谱条件进样分析，计算阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白当归素、洋川芎内酯A、欧前胡素、异欧前胡素峰面积的RSD，分别为0.63%、0.67%、0.48%、0.54%、0.72%、0.24%、0.38%，表明都梁丸供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一都梁丸6 份，精密称定，分别按供试品溶液制备方法制备6 份，按“2.1”项下色谱条件进样分析，分别测定阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白当归素、洋川芎内酯A、欧前胡素、异欧前胡素含量并计算RSD，分别为0.99%、1.55%、1.47%、1.16%、0.91%、1.34%、1.37%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取已知含量都梁丸约3 g，平行6 份，分别加入等量的硅藻土，研匀，分别取约 1 g，精密称定，分别加入阿魏酸（0.232 mg/mL）0.65 mL、洋川芎内酯Ⅰ（0.209 mg/mL）0.35 mL、水合氧化前胡素（0.136 mg/mL）0.25 mL、白当归素（0.060 mg/mL）0.55 mL、洋川芎内酯A（0.422 mg/mL）1.8 mL、欧前胡素（0.160 mg/mL）2.2 mL、异欧前胡素（0.125 mg/mL）1.5 mL，其余按供试品溶液制备方法操作，分别计算加样回收率和RSD，结果见表2。

表2 加样回收率测定结果（n = 6）Tab.2 Determination results of sample recovery（n = 6）

2.5 一测多评法的建立

2.5.1 相对校正因子的计算 取欧前胡素为内参物（S），按公式fk/m＝fk/fm＝Wk/Wm×（Am/Ak）分别计算阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白当归素、洋川芎内酯A、异欧前胡素的相对校正因子，式中Wk和Ak分别为内参物的峰面积和浓度，Wm和Am分别为其他组分m 的峰面积和浓度[9]。阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白当归素、洋川芎内酯A、异欧前胡素和内参物欧前胡素间的校正因子分别为1.236 2、0.427 3、2.600 4、1.247 9、0.108 8、0.846 4。

2.5.2 相对校正因子及色谱峰定位的相对保留值的重复性考察 主要考察安捷伦1100 和岛津LC-20AT 高效液相色谱仪， Agilent（250 mm×4.6 mm，5μm）和Diamonsil（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱以及三种不同温度（25、30、35℃）对相对校正因子及色谱峰定位的相对保留值的影响，结果各成分相对校正因子的RSD ≤1.75%，各成分的色谱峰定位的相对保留值的RSD ≤0.3%，结果稳定可靠，符合一测多评法的相关要求。

2.5.3 一测多评法（QAMS）与外标法含量测定结果的比较 精密吸取10 批都梁丸供试品溶液各10μL，按“2.1”项下的色谱条件测定，分别采用外标法与QAMS 法计算都梁丸中7 种成分含量[10]，结果表明两种方法测定的结果RSD 均小于2%，表明QAMS 法适用于都梁丸多成分的测定，测定结果见表3。

表3 10 批都梁丸样品中7 种成分含量测定结果（%，n = 3）Tab.3 Determination results of 7 components in 10 batches of Duliang pills (%, n = 3)

3 讨论

目前都梁丸含量测定主要以欧前胡素或阿魏酸为含量测定指标，对于都梁制剂的其他剂型中有些采用了多指标含量测定，如采用HPLC 法同时对都梁软胶囊中花椒毒酚、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素、氧甲基异欧前胡内酯进行测定[11]，对都梁滴丸中的阿魏酸、5-甲氧基补骨脂素、欧前胡素、异欧前胡素进行测定[12]。但指标的选择依据不足，对白芷测定的成分较多，川芎测定成分较少。本研究结合都梁丸指纹图谱色谱峰分离度、含量及血清药物化学研究结果[8]，选择入血原型成分阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、水合氧化前胡素、白当归素、欧前胡素、洋川芎内酯A、异欧前胡素7 种成分作为都梁丸含量测定的多指标成分，涵盖了酒炖白芷中4 种成分，川芎中3种成分，能够表征测定都梁丸中药效物质，提高都梁丸的质量控制标准。

在含量测定研究中，根据7 种成分的紫外吸收波长，选取了254 nm 和300 nm 对测定波长进行考察，结果在300 nm 测定波长下，待测成分信号强，杂质干扰少，故确定300 nm 为测定波长。对甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水等流动相系统进行了考察，结果以乙腈-0.1%磷酸溶液系统的待测成分的分离效果最佳，基线波动平稳。采用稀乙醇和70%甲醇对供试品溶液制备的提取溶剂进行考察，结果采用70%甲醇提取较为完全，杂质干扰少，故选择70%甲醇作为提取溶剂。

4 结论

本研究采用HPLC 法与QAMS 法建立了同时测定都梁丸中7 种成分的含量测定方法，方法简单、准确可行，可用于都梁丸的质量评价和指纹图谱及药效物质基础的深入研究。