槲皮素改善4-硝基喹啉-1-氧化物诱导小鼠食管癌作用机制研究

郭 政，唐艳萍，李明莉，杨 磊，李培彩，刘 磊，刘 茜，弓艳霞

（1.天津中医药大学 研究生院，天津 301617；2.天津市南开医院 消化内科，天津 300000；3.天津医科大学 研究生院，天津 300070）

食管癌是世界上七大常见癌症之一，致死率较高[1]，其发病隐匿、预后差，且具有一定地域性[2-3]。在欧美食管腺癌较为常见，而我国鳞状细胞癌更常见[4-5]。鳞状细胞癌造成的危害极大，其期前病变为食管上皮细胞异型增生改变，程度越深风险越高[5-6]。西医治疗以手术或联合放化疗方案为主，取得了许多成就，但化疗药物的无差别损伤，会一定程度的损伤机体正常功能，降低患者生存质量[7-8]。因此寻找毒副作用低的药物对于食管癌的治疗至关重要，中医药具有减毒增效的优势，在治疗肿瘤的过程中可以发挥不错的效果。《景岳全书》曰：“噎膈一症，必以忧愁思虑，积劳积郁，或酒色过度，损伤而成[9]。”中医认为食管癌病位在食管，病因与酒食过度、七情内伤、过劳、久病、年老等有关，气、痰、瘀交阻，津气耗伤、胃失和降而致。槲皮素是天然黄酮类物质，具有抗氧化、抗炎抗肿瘤等多种作用[7-8]。 槲皮素作为白花蛇舌草、半枝莲、黄芪等具有抗癌抗肿瘤中药的有效活性成分，无毒食用安全性高[10-12]。Th17/Treg 细胞失衡是癌症发生发展的重要因素[13]，而槲皮素恢复Th17/Treg 平衡有良好成效[14-15]。本文通过4NQO 饮水法诱导食管癌的小鼠模型，探讨槲皮素干预食管癌的作用机制，为槲皮素的进一步应用提供依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级，雌性C57BL/6N 小鼠20 只，6 周龄，体质量为（22±2）g（北京维通利华动物实验有限责任公司），实验动物许可证号：SCXK（京）2021-0006。饲养于中国医学科学院放射医学研究所SPF 级动物房，光照和黑暗各12 h 交替进行，自由进食标准颗粒饲料。动物实验由天津市南开医院实验动物伦理委员会批准（伦理审查编号：NKYYDWLL-2022-109）。

1.2 药物与试剂

4NQO（上海源叶生物科技有限公司，纯度＞98%，批号：S48468）；槲皮素（Quercetin，上海源叶生物科技有限公司，分析标准品，纯度≥98%，批号：B20527）；奥美拉唑肠溶胶囊（锦州九泰药业有限责任公司，批号：211201）；多潘立酮片（西安杨森制药有限公司，批号：MBJ6814）；铝碳酸镁咀嚼片（江苏万高药业股份有限公司，批号：JS14487）；AKT Rabbit Polyclonal antibody（10176-AP，Protintech）；Phospho-AKT（Ser473） Mouse Monoclonal antibody（66444-1-lg，Protintech）；PI3K Kinase p85 Alpha Mouse Monoclonal antibody（60225-1-lg，Protintech）；GAPDH Rabbit Polyclonal antibody（10494-1-AP，Protintech）；增强型化学发光试剂（36208ES60，翌圣生物公司）；TNF-α检测试剂盒（MEA133Mu，Clould-Clone Corp）；IL-17 Elisa 检测试剂盒（MEA063Mu，Clould-Clone Corp）；IL-10 Elisa 检 测 试 剂 盒（MEA056Mu，Clould-Clone Corp）等。

1.3 主要仪器

ChemiDoc XPS 型化学发光成像仪、1645050 型电泳仪（美国伯乐生命医学产品有限公司）；DM500型光学显微镜（德国徕卡仪器有限公司）；ST36 型酶标仪（上海科华生物工程股份有限公司）；H2050R型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；NovoCyte 型流式细胞仪（深圳市达科为生物技术股份有限公司）等。

2 方法

2.1 动物造模及给药

小鼠适应性喂养一周，参考文献[16]，将24 只C57B/L 小鼠，随机分正常组、模型组、西药组和槲皮素组，每组5 只。除正常组外，其他小鼠采用饮水法给予4NQO（100 μg/mL 溶于蒸馏水），连续16 周，以构建早期食管癌模型。造模的同时开始给予药物灌胃治疗，每日两次。正常组和模型组给予生理盐水灌胃作对照，西药组（奥美拉唑1.52 mg/d+铝碳酸镁56.89 mg/d+吗丁啉1.14 mg/d，溶于蒸馏水）[17]，槲皮素组（50 mg/kg/d，溶于蒸馏水），16 周后，将各组4NQO 换为正常纯净水，直至20 周。

2.2 小鼠一般情况观察

以造模开始时的小鼠体质量为基础体质量，相对体质量=当天测量体质量（g）/基础体质量（g）×100%[18]。记录造模后小鼠体质量，每周测量一次。取材时记录小鼠脾脏、胸腺指数[19]，胸腺指数=胸腺质量（mg）/小鼠体质量（g）×100%，脾脏指数=脾脏质量（mg）/小鼠体质量（g）×100%。

2.3 HE 染色观察食管下段黏膜组织病理变化

取小鼠食管与胃交界处上5 mm 至10 mm 段食管组织石蜡包埋切片，4%多聚甲醛固定24 h，75%乙醇处理，石蜡包埋切片，HE 染色，脱水封片，显微镜下观察食管组织病理学变化。

2.4 流式细胞分析脾脏Treg 和Th17 细胞比例的变化

在小鼠处死后，取脾脏组织通过40 μm 过滤器在10 mL PBS 中研磨。然后在组织离心后进行沉淀，并用红细胞裂解液去除红细胞，将细胞进行固定破膜和染色后，加入200 μL PBS 重选。使用NovoCyte流式细胞仪进行检测，并使用NovoCyte 软件分析结果。标记为CD4+IL17A+细胞是Th17 细胞，标记为CD4+CD25+FOXP3+细胞是Treg 细胞。

2.5 酶联免疫吸附法检测血清中IL-10、IL-17、TNF-α 的表达情况

将血高速离心后分离血清，按照IL-10、IL-17、TNF-α 检测试剂盒说明书步骤测定各组血清中IL-10、IL-17、TNF-α 表达变化。

2.6 蛋白免疫印迹法检测食管组织中PI3K、AKT、p-AKT 蛋白的表达

提取各组食管组织总蛋白，BCA 法测定样本蛋白浓度。在合适浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(SDSPAGE)后转至PVDF 膜上，快速封闭液封闭，一抗4℃孵育过夜，TBST 洗膜，二抗孵育2 h，TBST 洗去残余二抗，滴显色液后显影观察，并用Image J 软件分析条带灰度值。

2.7 统计学方法

用Graphpad Prism 7.0 软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况

正常组小鼠外形可见其皮毛黑泽光亮，形体匀称，活动正常；模型组小鼠皮毛灰暗无光泽，形体明显瘦小，活动明显减弱，呈现生病状态；西药组小鼠皮毛比较光泽，形体稍瘦小，活动度较正常；槲皮素组小鼠皮毛比较光泽，形体正常，活动度正常。模型组分别在第15、17 周分别死亡1 只，西药组在第16 周死亡1 只，槲皮素组在第18 周死亡1 只。

模型组小鼠各阶段体质量均低于正常组（P＜0.01）；在前3 个月，西药组与槲皮素组小鼠体质量减轻程度相似，随着疾病的发展，相比西药组，槲皮素组小鼠体质量减轻的速度趋缓，即在食管癌诱发条件的环境中，早期对小鼠予药物干预，可改善小鼠生存质量，延缓肿瘤恶变进展。见表1。

表1 小鼠在不同时间的相对体质量情况（%， n = 5）Tab.1 Relative body mass of mice at different times（% ，n = 5）

4NQO 饮水法诱导后，模型组小鼠脾脏、胸腺指数低于正常组（P＜0.01），对小鼠给予槲皮素干预后，脾脏、胸腺指数有轻微上升，两者比较差异无统计学意义（P＞0.05），但药物治疗能够在一定程度上调节小鼠的免疫功能。见表2。

表2 小鼠脾脏、胸腺指数（mg/g ，n = 5）Tab.2 Spleen and thymus indices of mice（mg/g , n = 5）

3.2 槲皮素对食管组织形态的影响

3.2.1 肉眼观察结果 肉眼观察食管组织，正常组光滑无异常突起；模型组食管不均匀，甚可见重度糜烂、肿瘤样隆起，胃部伴随糜烂、水肿、肿大突起；西药组可见中、重度增厚、充血、糜烂，偶见肿瘤样小颗粒；槲皮素组食管表现为轻度增厚、充血，偶见糜烂及肿瘤样隆起。表明西药或槲皮素可不同程度地改善小鼠食管组织癌变程度，且槲皮素改善效果较为明显。见图1。

图1 小鼠食管组织肉眼观察结果Fig.1 Mouse esophageal tissues observed by the naked eye

3.2.2 HE 染色结果 镜下观察食管组织，正常组黏膜表面为复层鳞状上皮，模型组食管组织黏膜可见鳞状上皮和基底层细胞不同程度的增生，且有大量炎细胞浸润，并可见肿块形成；经过西药或槲皮素干预治疗后，西药组小鼠食管组织基底层炎细胞减少，鳞状上皮增生程度减轻，偶见肿块形成，槲皮素组基底层炎细胞于鳞状上皮增生程度均减少。见图2。

图2 HE 染色结果（100 ×）Fig.2 HE staining results (100 ×)

3.3 槲皮素对血清中TNF-α、L-17、IL-10 表达水平的影响

与正常组比较，早期食管癌模型组小鼠TNF-α、IL-17、IL-10 表达水平均不同程度增高（P＜0.01）；与模型组比较，西药组与槲皮素组小鼠TNF-α 表达水平均下降（P＜0.01），槲皮素组小鼠IL-10、IL-17表达水平也均下降（P＜0.01 或P＜0.05）。见图3。

图3 小鼠血清中TNF-α、IL-17、IL-10 的表达水平（n = 5）Fig.3 Expression levels of TNF-α, IL-17 and IL-10 in mice serum （n = 5）

3.4 槲皮素对Th17/Treg 免疫平衡的影响

模型组小鼠与正常组相比，脾脏中Th17 细胞数量占比下降（P＜0.01），Treg 细胞占比增高（P＜0.05）；与模型组比，西药组和槲皮素组小鼠脾脏中Treg 细胞占比降低（P＜0.05），槲皮素组Th17 细胞占比升高（P＜0.01），Th17/Treg 比例增高（P＜0.05）。见图4。

图4 槲皮素对Th17/Treg 免疫平衡的影响（n = 5）Fig.4 Effect of quercetin on Th17/Treg immune balance (n = 5)

3.5 槲皮素对PI3K、AKT、p-AKT 表达水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠食管组织中PI3K、AKT、p-AKT 表达水平均不同程度增高（P＜0.01）；经过槲皮素干预后，相比模型组，PI3K 表达水平降低（P＜0.01），p-AKT/AKT 下降，但两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图5 小鼠食管组织中PI3K 、AKT、p-AKT 表达水平Fig.5 Expression levels of PI3K, AKT and p-AKT in mouse esophageal tissues

4 讨论

本研究应用4NQO 诱导的小鼠食管癌模型，探讨了槲皮素改善4NQO 诱导小鼠食管癌的作用机制，发现槲皮素可以改善4NQO 诱导小鼠的一般情况，减轻4NQO对食管组织的损伤，并恢复Th17/Treg免疫平衡。

Th17/Treg 细胞平衡的改变是多种肿瘤发生发展的原因[20]。槲皮素可抑制食管癌细胞增殖，海棠叶提取液（其中包含槲皮素）可以通过调节IL-17 信号通路抑制4NQO 诱导的食管癌[21-22]，在本研究中也有相同的发现，在4NQO 诱导的食管癌小鼠中，Th17 细胞减少，Treg 细胞明显增加，即Th17/Treg 平衡失调，经槲皮素治疗后，Th17/Treg 比例增加，所以恢复Th17/Treg 免疫平衡可能是改善食管癌进展的原因。

Th17 细胞由CD4+T 细胞分化而来，参与形成瘤微环境，可分泌细胞因子IL-17，而IL-17 可通过促进血管生成、抗肿瘤凋亡蛋白表达，从而促进肿瘤细胞的产生[23]。但其他细胞（CD8+T 细胞、γδ T 细胞、固有免疫细胞、自然杀伤细胞、恒定自然杀伤T 细胞、黏膜相关恒定T 细胞、肥大细胞和潘氏细胞）也能产生IL-17，此外，Th17 细胞在体内表现出细胞因子生产的可塑性，可以从主要生产IL-17 转变为主要生产IFN-γ，也可能停止产生IL-17[24-25]，所以Th17和IL-17 的数量变化可能不完全一致。Treg 细胞是免疫抑制性细胞，可通过分泌细胞因子IL-10 抑制免疫效应细胞的功能，另外，IL-10、TNF-α 参与了癌症的发生发展[26-27]。

在本研究中，4NQO 诱导的食管癌小鼠食管中Th17 细胞减少、IL-17 增多，可能是因为其他细胞产生了IL-17。经槲皮素治疗后，Th17 细胞数量升高，IL-17 减少，可能是Th17 细胞由生产IL-17 转变为其他物质，或者停止生产IL-17 所导致，具体机制尚不清楚，需要进一步探究。

抑制PI3K/AKT 信号通路激活，恢复Th17/Treg免疫平衡则可抑制肿瘤进一步形成[28]。在本研究中，4NQO 诱导的食管癌模型中，发现小鼠食管组织PI3K、p-AKT/AKT 蛋白表达增加，即AKT 通路激活，经槲皮素干预后，PI3K 蛋白明显下降、Th17/Treg 平衡改变，提示槲皮素可能是通过抑制PI3K/AKT 通路改善食管癌小鼠Th17/Treg 细胞失衡进而延缓食管癌进展，从而提高食管癌小鼠生存率，为槲皮素在食管癌中的应用提供了理论支撑。

5 结论

槲皮素通过调节Th17/Treg 平衡从而发挥抑制4NQO 诱导的小鼠食管癌的作用，本研究为临床应用槲皮素防治食管癌提供了一定理论依据，但如何调节Th17/Treg 平衡还待进一步探索。