基于ITS2 序列的黔产金线莲及其常见易混品分子鉴定研究

黄 哲，杨 烨，王世清，党友超，王 锦

（1.贵州中医药大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.浙江圣兆药物科技股份有限公司分析中心，浙江 杭州 310051）

金线莲为兰科开唇兰属植物花叶开唇兰Anoectochilus roxburghii(Wall）Lingl.的干燥全草[1]，其性平、味甘，具有清热解毒、生津养颜、祛风利湿、镇惊平肝、扶正固本、润肺止咳等功效[2-4]，在抗炎、降血糖等方面有良好的生物活性[5]。近年来，金线莲的使用较为混乱，在福建、浙江、贵州等地区常将同科植物银线莲Goodyera hachijoensisYatabe、斑叶兰Goodyera schlechtendalianaRchb.f.的干燥全草混做金线莲药用，由于性状相似，并且化学组分复杂，现有的形态鉴别[6-8]等方法难以对金线莲的品种及质量进行较为完整的评价。ITS2 是植物物种鉴定的核心条形码，也是系统发育分析最常用的基因之一，在药用植物鉴定和保护、入侵物种的防治等领域发挥着不可或缺的作用[9-10]。目前，金线莲在分子鉴定方面的研究主要是利用分子标记技术进行种质资源鉴定和遗传多样性分析[11-16]，以ITS2 为主的品种鉴定研究鲜见报道。因此，本研究以ITS2 序列为模版，对所收集的开唇兰属植物西南齿唇兰Anoectochilus elwesii(Clarke ex Hook.f.)King et Pantl.、兴仁金线兰Anoectochilus xingrenensisZ.H.Tsi & X.H.Jin、斑叶兰属植物斑叶兰Goodyera schlechtendalianaRchb.f.等5种植物样品进行ITS2 序列扩增及测序，同时在NCBI下载台湾金线莲Anoectochilus formosanus Hayata、小斑叶兰Goodyera repens(L.)R.Br.等6 种相关ITS2 序列，对所得序列采用种内种间遗传距离、聚类分析及ITS2 序列二级结构进行分析与鉴定，以期能有效区分黔产金线莲及其常见易混品。

1 材料

1.1 仪器与试剂

3730XL 型测序仪（美国安捷伦科技公司）；Legend Micro17 型离心机、2720 thermal cycler 型PCR仪（美国赛默飞世尔科技公司）；JY300C 型电泳仪、JYDF(定制)型电泳槽、JY04S-3C 型凝胶成像仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；DFD-700 型水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；L550 型板式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；引物（批号：ESO5222591）购于英潍捷基(上海)贸易有限公司；2x TSINGKE Master Mix（批号：TSE003）、TSINGKE高纯度低电渗琼脂糖（批号：TSJ001）、DNA 凝胶回收试剂盒（批号：TSP602-200）、DL2000 Marker（批号：TSJ011-100）购于北京擎科生物科技有限公司。

1.2 样品

药材样本来源于市售及野外采集或NCBI 下载，经贵州中医药大学王世清教授鉴定为兰科植物花叶开唇兰（金线莲）Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.、 西 南 齿 唇 兰Anoectochilus elwesii(Clarke ex Hook.f.)King et Pantl、 兴 仁 金 线 兰Anoectochilus xingrenensisZ.H.Tsi & X.H.Jin、斑叶兰属植物斑叶兰Goodyera procera(Ker-Gawl.) Hook.和白网脉斑叶兰（银线莲）Goodyera hachijoensisYatabe 的全草。标本存放于贵州中医药大学生药实验室，药材信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Sample information

2 方法

2.1 DNA 的提取

取药材适量，用75%乙醇进行表面消毒后，用刀片刮取内部药材约20 mg，加液氮冷冻，用球磨仪加入一粒小钢珠研磨40 s(50 Hz/s)后，按DP336 试剂盒提取，4 ℃保存备用。

2.2 PCR 的扩增及测序

扩增、测序引物一致，引物ITS2-2F：5'-ATGC GATACTTGGTGTGAAT-3'； 反 向 引 物ITS2-2R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。PCR 扩增体系为25 μL，体系包括：正向引物和反向引物各2 μL，DNA 模板2 μL，加ddH2O 水至25 μL。扩增程序：98 ℃，变性3 min；98 ℃，变性10 s；53 ℃退火15 s；72 ℃延伸10 s；35 个循环。72 ℃延伸5 min。PCR 扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由成都擎科生物技术有限公司进行双向测序。

测序所得的峰图采用Codon Code Aligner V5.0软件(Codon CodeCo，USA) 对序列峰图进行校对拼接，去除引物区和低质量的序列，获得ITS2 序列。利用MEGAX6.4 计算物种种内和种间Kimura2-parameter(K2P) 遗 传 距 离， 构 建 邻 建(Neighborjoining，NJ)系统发育树，利用Bootstrap(BS)(1 000 次重复)检验各分支的支持率。采用软件The ITS2 Database 获得ITS2 序列二级结构。

3 结果与分析

3.1 金线莲及其常见易混品植物ITS2 序列分析

利用MEGAX6.4 软件对纳入的金线莲及其常见易混品植物ITS2 序列进行变异分析，得到各品种植物的ITS2 序列长度在325 ～ 329 bp，GC 含量平均值在51.27% ～ 53.58%。各种间的变异位点为71 个，保守位点为261 个，简约信息位点为52 个，见表2。

表2 ITS2 序列信息表Tab.2 ITS2 sequence information table

各品种的序列种间K2P 遗传距离分布于0.005 0 ～0.109 9，平均遗传距离为0.065 0，而种内K2P 遗传距离分布与0 ～ 0.001 8。金线莲与各品种间的遗传距离差异较大。其中，金线莲和台湾金线莲种间差异最小，遗传距离为0.005 0，最大的是银线莲，遗传距离为0.109 9。各个种的种内和种间遗传距离详情见表3。

表3 种内和种间遗传距离Tab.3 Intraspecific and interspecific genetic distance table

3.3 金线莲及其常见易混品植物NJ 进化树鉴定

基于ITS2 序列构建金线莲及其常见易混品植物间的NJ 系统聚类树，见图1。从聚类树上可以看出，各植物按照每个物种的ITS2 序列均单独聚为一支，Bootstrap1 000 次重复，各分支支持率较高，金线莲Bootstrap1 000 支持率达到94%，呈现出良好的单系性。

图1 NJ 系统聚类树Fig.1 NJ system clustering tree

3.4 金线莲及其常见易混品植物ITS2 二级结构预测

通过The ITS2 database 在线预测金线莲及其常见易混品植物的二级结构，见图2。可以看出金线莲及其常见易混品植物的二级结构符合被子植物一环（主环）四臂（4 个螺旋区）的特征[13]。除兴仁金线兰、丽蕾金线莲与台湾金线莲外，金线莲与其它品种的二级结构存在明显差异，具体表现在四个臂长短不同，茎环数目大小也有差异。其中，兴仁金线兰、丽蕾金线莲、台湾金线莲和金线莲包含13 个内环，4 个发夹环；银线莲包含9 个内环，4 个发夹环，主茎环多出数目不等的非闭合小茎环；斑叶兰包含11 个内环，4 个发夹环，其中，I 臂上的发夹环明显大于其它种，主茎环多出数目不等的非闭合小茎环；西南齿唇兰、高雄金线莲、小斑叶兰包含11 个内环，4 个发夹环，但环的大小、角度和位置上有一定的区别。综上所述，ITS2 二级结构特点可作为区分各品种间的辅助指标之一，可为准确、有效地鉴别中药材金线莲及其常见易混品物种提供重要参考。

4 讨论

本文利用目前被广泛认可的DNA 条形码ITS2 序列片段对金线莲及其常见易混品植物进行鉴别，金线莲的ITS2 的序列长度在329 bp，种内距离为0.001 8。从遗传距离上看金线莲与台湾金线莲、高雄金线莲、丽蕾金线莲之间的种间遗传距离较小，表明四者间的亲缘关系较近。而金线莲与兴仁金线兰、西南齿唇兰、银线莲、斑叶兰、小斑叶兰的最小种间距离为0.038 8，最大种间距离为0.109 9，表明金线莲的种内平均K2P 遗传距离远小于种间遗传距离，并已达到序列差异的标准阈值(即种间遗传距离超过种内遗传距离的十倍，两者存在明显的间隙)，种内和种间存在一个明显的“Barcoding Gap”区域[17]。此外，由构建的邻接树可以看出，金线莲单独聚成一支，并与其他品种植物明显区分开。

5 结论

本研究采用DNA 条形码分子鉴定对金线莲及其常见易混品共8 种植物进行品种综合鉴定研究，方法简便，结果准确，能有效区分金线莲及其常见易混品植物，为后期探索黔产金线莲的鉴定特征以及金线莲的开发和保障临床安全用药提供参考。后续研究应以ITS2 及其二级结构作为鉴别依据对金线莲及同科同属植物进行考察和筛选，进而为金线莲的持续开发提供依据。