不同品种龟甲的光谱学特征研究

张 琳，戴仕林，党静洁，石遵睿，周佩娜，吴啟南,3*

（1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023 ；2.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏南京 210023；3.中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023）

2020 年版《中国药典》规定龟甲药材基原动物为乌龟Chinemys reevesii（Gray），但龟甲在中药材市场中还存在巴西龟、中华花龟、黄喉拟水龟等其他基原物种龟甲流通的情况。以2020 年版《中国药典》为依据，其他基原物种的龟甲视作乌龟甲的伪品。前期研究表明不同物种的龟科动物其龟甲的浸出物、蛋白质、氨基酸、无机元素等指标性质量评价成分存在一定程度差异[1-2]，通过对龟甲化学成分的宏观信息分析，利用DNA[3]、蛋白质[4]、多肽[5]等专属性成分进行分析，可达到乌龟甲和其他基原物种龟甲的正、伪品鉴别目的。但现有的龟甲基原物种鉴定技术需要依靠较复杂的分子生物学处理和操作条件，因此基于药食原料快捷检验和简化鉴定操作流程的需求，龟甲的正伪品鉴别仍需发掘能够用于快速鉴别的特征信息数据。光谱学检测技术作为重要的高效无损鉴别方法，现广泛应用于动植物及其加工品的产地鉴别[6]、品种鉴别[7]、含量预测[8]等定性与定量检测。本研究采用一维红外光谱和拉曼光谱分析龟甲指纹图谱信息，红外光谱的一阶和二阶导数谱及热微扰二维相关谱分析不同基原物种龟甲样品间谱学差异；采用傅里叶变换近红外漫反射光谱结合化学计量学分析对龟甲建立正伪品识别模型，旨在补充龟甲的光谱学特征信息，为龟甲的光谱学快速鉴别提供依据。

1 材料

1.1 仪器与试剂

HR Evolution 型高分辨拉曼光谱仪（ 日本HORIBA 公司）；Nicolet iS5 型傅里叶变换红外光谱仪、Antaris II 型傅里叶变换近红外光谱仪（美国Thermo Fisher 公司）；IRAffinity-1S 型傅里叶变换红外光谱仪及金刚石探头ATR 附件和程序升温附件（日本岛津公司）；OUG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；溴化钾（批号：20200110，国药集团化学试剂有限公司，光谱纯）。

1.2 样品

正、伪品龟甲药材样品购置于各药材市场及加工产地，经南京中医药大学药学院吴啟南教授鉴定为乌龟Chinemys reevesii（Gray）、巴西龟Trachemys scripta elegans(Wied)、 中 华 花 龟Ocadia sinensis（Gray）、黄喉拟水龟Mauremys mutica（Cantor）干燥的背甲或腹甲，见表1。

表1 龟甲样品信息表Tab.1 Information sheet of tortoise shell samples

2 方法

2.1 样品前处理

所有样品均用水刷洗去除表面杂质，40℃烘干，干燥后的样品粉碎后过6 号药典筛（100 目），将过筛样品粉末60℃烘干3 h 并冷却至室温后，密封储存作为测定供试品。其中，编号W1 ～ W6、B1 ～ B6、Z1 ～ Z6、H1 ～ H6 的样品为红外光谱和拉曼光谱采集供试品。

2.2 拉曼光谱采集

激发波长为633 nm，功率为50 mW，积分时间为10 s，循环3 次，空间分辨率为1μm，光谱分辨率为2.0 cm-1，采集的光谱波数范围为4 000 ～ 100 cm-1。

2.3 红外光谱采集

分别将供试品粉末与干燥KBr 粉末以1 ∶20 的比例放入玛瑙研钵中进行研磨，混合均匀并压制为半透明薄片，制得供试品片。红外光谱仪扫描波数范围为4 000 ～ 400 cm-1，累计扫描16 次，分辨率为4 cm-1，数据格式为透过率，以溴化钾为背景进行扫描，扫描时进行自动大气背景扣除。

2.4 二维相关红外光谱采集

以每物种组的混合样品作为供试品，采用衰减全反射(ATR)法扫描样品，扰动条件为温度，升温速率为2.5℃/min，升温范围为50 ～ 120℃，常温时采集一次红外光谱，此外每10℃采集一次红外光谱。扫描波数范围为4 000 ～ 600 cm-1，累计扫描32 次，分辨率为4 cm-1，数据格式为吸光度。

2.5 近红外光谱采集

近红外光谱测定和分析分为正品（乌龟，T）、伪品（巴西龟、中华花龟、黄喉拟水龟，F）2 组。近红外光谱仪扫描波数范围为10 000 ～ 4 000 cm-1，采样技术为积分球漫反射，累计扫描32 次，分辨率为8 cm-1，数据格式为吸光率，衰减器为Empty，增益2×。每个样品重复扫描3 次，其平均光谱作为该样品原始光谱。

3 结果与分析

3.1 方法学考察

选用样品W1 对“2.2”和“2.3”项进行方法学考察，采用OMNIC 8.2 软件进行相关性分析。“2.2”项下样品制片并重复测定6 次，相关系数为100.00、87.49、79.39、83.18、84.43、85.14，精密度RSD 为7.47%；样品重复制片6 次并测定，相关系数 为100.00、95.85、96.23、94.19、95.66、95.89，重复性RSD 为1.84%；样品制片存放于干燥器内，于0、1、2、3、4、5 h 测定，相关系数为100.00、97.00、96.77、96.48、95.21、94.00，稳定性RSD 为1.91%。“2.3”项方法学考察条件同“2.2”项，精密度测定样品相关系数为100.00、99.98、99.98、99.97、99.97、99.97，RSD 为0.01%；重复性测定样品相关系数为100.00、99.63、99.49、99.47、99.53、99.01，RSD 为0.29%；稳定性测定样品相关系数为100.00、97.93、97.96、97.64、97.82、97.78，RSD 为0.83%。方法学考察表明实验条件良好。

3.2 拉曼光谱分析

原始数据经Origin 2022 软件进行归一化处理，计算各样品组平均光谱为分析对象。吸收峰及对应基团推测见表2[9-12]。4 组供试品拉曼平均光谱图主要吸收区域在400 ～ 1 700 cm-1、2 800 ～ 3 000 cm-1，见图1。431.83 cm-1、587.99 cm-1、958.86 cm-1附近的吸收峰与磷酸盐相关；1 072.07 cm-1附近的吸收峰与碳酸盐相关；709.00 cm-1、857.36 cm-1、1 298.50 cm-1（1 230.77 cm-1、1 245.49 cm-1）、1 657.66 cm-1附近吸收峰峰形反应氨基酸和酰胺带响应情况，其中酰胺Ⅲ带C—N 振动峰峰值波数差异表明乌龟、巴西龟与中华花龟、黄喉拟水龟间与酰胺Ⅲ带相关蛋白质有一定特征性。

图1 拉曼平均光谱图Fig.1 Average Raman spectrogram

表2 拉曼光谱吸收峰初步指认Tab.2 Preliminary identification of Raman absorption peaks

3.3 三级红外光谱分析

3.3.1 原始光谱 原始数据经OMNIC 8.2 软件进行自动基线校正、自动平滑以消除基线影响及优化峰形，计算各样品组平均光谱为分析对象，输出.csv格式数据经Origin 2022 软件作谱线图，见图2。4 组供试品红外平均光谱图主要吸收区域在3 600 ～3 100 cm-1、2 950 ～ 2 850 cm-1、1 750 ～ 1 300 cm-1、1 250 ～ 1 200 cm-1、1 200 ～ 850 cm-1、700 ～ 500 cm-1附近，吸收峰在1 750 ～ 500 cm-1波段内较为密集。吸收峰及对应基团推测见表3[13-14]。4 组供试品红外平均光谱图的谱线趋势、峰数、峰形相近，以乌龟供试品平均光谱为检索库，计算谱图匹配度分别为巴西龟98.70、中华花龟99.08、黄喉拟水龟90.93，表明各物种龟甲所含化学成分的组成及含量具较高相似度；1 746.23 cm-1附近的饱和脂肪酸酯吸收峰表明供试品所含脂肪酸类成分含量差异；1 023.63 cm-1附近吸收峰代表供试品含多糖；896.72 cm-1附近的吸收峰代表供试品含硫酸盐；1 660.14 cm-1、1 540.15 cm-1、1 448.84 cm-1、1 409.71 cm-1、1 237.54 cm-1、601.02 cm-1的酰胺带吸收峰表明不同龟甲样品氨基酸、蛋白质的种类和含量相近。乌龟样品在1 540.15 cm-1附近呈平滑的单峰峰形，与伪品峰形相比具有差异，伪品中黄喉拟水龟样品的红外平均光谱 在1 574.06 cm-1、1 511.30 cm-1、1 540.15 cm-1附 近吸收峰表明其蛋白质成分与其它样品可能存在相对较大差异。

表3 红外光谱吸收峰初步指认Tab.3 Preliminary identification of IR absorption peaks

3.3.2 二阶导数光谱 结合导数谱线峰形差异及“3.3.1”项中特征峰区段，选取显示波数范围为1 800 ～ 600 cm-1，见图3。二阶导数谱图表明4 组供试品在1 238.26 ～ 1 202.61 cm-1、959.57 ～ 944.35 cm-1波段的峰形均有明显差异，可作为4 种龟甲样品的鉴别区段；此外黄喉拟水龟在1 749.28 cm-1、1 574.78 cm-1、633.04 cm-1附近与其余3 组具峰形差异，中华花龟在802.61 cm-1附近与其余3 组具峰形差异。

图3 红外平均光谱二阶导数图Fig.3 The second derivative of the infrared average spectra

3.3.3 二维相关光谱 对供试品进行大气校正和平滑处理，据前期研究及“3.2”项特征光谱信息密集区域选取1 800 ～ 1 300 cm-1波段红外光谱数据进行温度微扰二维相关分析[15-16]，见图4。乌龟有1 组主要的自动峰（1 516 cm-1，1 516 cm-1）和2 组次要的自动峰（1 751 cm-1，1 751 cm-1），（1 683 cm-1，1 683 cm-1）；巴西龟有2 组主要的自动峰（1 537 cm-1，1 537 cm-1），（1 427 cm-1，1 427 cm-1） 和1 组 次 要 的 自 动 峰（1 635 cm-1，1 635 cm-1）；中华花龟有2 组主要的自动峰（1 641 cm-1，1 641 cm-1），（1 539 cm-1，1 539 cm-1）和1 组次要的自动峰（1 435 cm-1，1 435 cm-1）。黄喉拟水龟有2 组主要的自动峰（1 556 cm-1，1 556 cm-1），（1 529 cm-1，1 529 cm-1）和2 组 次 要 的 自 动 峰（1 635 cm-1，1 635 cm-1），（1 462 cm-1，1 462 cm-1）；通过样品在1 800 ～ 1 300 cm-1波段的同步二维红外光谱图可以发现，4 种类似的样品在该波段的同步二维红外光谱图存在明显差异，通过自动峰和谱图差异进一步佐证4 种龟甲其蛋白质组成差异，且可以通过自动峰的峰位、数量和强弱有效的区分4 种样品。

图4 二维相关红外光谱图Fig.4 Two-dimensional correlation infrared spectra

3.4 近红外光谱分析

SIMCA 14.1 软件使用分析类型正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），设定供试品W21 ～ W28、B7、B8、Z7、Z8、H7、H8 为验证集，其余供试品为校正集。数据预处理使用Con、MSC、SNV 与单位方差标准化（Unit variance scaling，UV）、中心化（Center scaling，Ctr）、柏拉图标准化（Pareto scaling，Par）以上2 组预处理模块的不同处理方式组合处理。选用校正集光谱二阶导数数据，对各组合处理方法进行验证，以7 折交叉验证确定最优主成分数，以模型累计解释率和累积预测率参数选取最优预处理方法（表4）。R2X（cum）为X轴方向模型的累积解释率；R2Y（cum）为Y轴方向模型的累积解释率；Q2（cum）为模型的累积预测率。选择最优预处理方法对建立的判别模型进行OPLS-DA 得分图分析（图5），Con+Ctr 处理方法R2X（cum）、Q2（cum）为最高值，Con+Par 处理方法R2Y（cum）为最高值，得分图表明Con+Ctr 处理方法在坐标系中样品点具有更集中的聚类分布趋势，因此采用FD+Con+Ctr 的预处理方法进行模型检验。

图5 校正集 Con+Ctr（A）和Con+Par（B）处理的OPLS-DA 得分图Fig.5 Calibration sets Con+Ctr (A) and Con+Par (B) treated OPLS-DA scores

表4 数据预处理方法对OPLS-DA 模型参数的影响Tab.4 The influence of data preprocessing method on parameters of OPLS-DA model

置换检验法采用样本数据随机排列重新计算统计检验量的方式，对选定的Y 变量进行响应置换测试，提供解释率（R2）、预测率（Q2）参考分布，与原始数据R2Y（cum）、Q2（cum）对比进行可靠性验证[17]。对校正集模型置换检验，校正集T 组和F 组进行200 次随机排列得到置换检验图（图6）。校正检验随机点Y值均小于右端点，图6A 中拟合直线方程=0.614X+0.254，=1.435X-0.634；图6B 中拟合直线方程=0.595X+0.273，=1.419X-0.618。置换检验证明模型可排除过拟合现象。使用模型对验证集进行预测，预测结果T 组与F 组正确率均为100%，见表5。

4 讨论

研究采用红外光谱三级鉴定法和拉曼光谱法分析不同基原物种龟甲的指纹图谱信息及光谱学特征差异，并采用傅里叶变换近红外漫反射光谱结合化学计量学分析对龟甲正伪区分初步建立模型识别体系。通过拉曼光谱、一级红外及导数谱鉴定分析确立目标信息区段，初步确定龟甲各级鉴别模式下的指纹图谱特征信息，对龟甲的化学成分组成信息总结初步推论，并由对差异波段所属基团归类上溯化合物差异，表明各基原物种龟甲的标志性成分为多糖、脂肪酸、氨基酸和蛋白质。进行高分辨率和针对性的二维相关特征光谱分析，通过不同温度条件下的光谱动态变化信息对龟甲的多糖类成分、蛋白质类成分的特征峰进行定位，并由蛋白质特征峰区域的自动峰差异形成鉴别特征。经三级鉴定分析确立目标信息区段进行分辨率逐级提高的特征光谱分析，从而建立不同基原物种龟甲类药材整体指纹图谱信息和指纹区域的高分辨分析模式，对龟甲的化学成分组成由一维红外光谱信息总结初步推论，并由对差异波段所属基团归类上溯化合物差异，对进一步分析不同品种龟甲化学成分差异提供了研究思路。此外，龟甲小分子蛋白和肽类物质在前期研究表明具有显著的抗癫痫、促成骨等药理作用[18]，多不饱和脂肪酸具有抗炎、降低胆固醇、保护心脏、改善大脑和神经功能等作用[19]，目前龟甲的化学成分研究仍有较大探索空间，红外光谱特征峰峰位及吸收强度的差异与化学成分的关联性还需通过对龟甲化合物分离与鉴定技术进行深入研究，后续对相关化合物的定量分析结合光谱学进行标志峰分析和预测模型可建立龟甲功效物质含量预测和分析体系。

5 结论

本研究建立了龟甲的光谱学快速鉴别方法，同时为龟甲含量预测和判别分析研究提供数据基础，为龟甲的质量控制和无损快速检测应用提供了新的发展方向。但龟甲化学成分与光谱学特征的关联性还需进一步研究，以及对于判别模型需要针对实际应用需求扩大样本量进行构建和优化，后续可通过无损快速检测模式结合化学计量学方法和化学成分测定，针对特征性基团对应的物质进行进一步的定性和定量分析。