响应曲面法优选蜜百合的炮制工艺研究

郭志俊，高 波，2

(1 华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110；2 安徽华润金蟾药业股份有限公司，安徽 淮北 235000)

百合为百合科植物卷丹LiliumlancocifoliumThunb.、百合LiliumbrowniiF·E·Brownvar.viridulumBaker或细叶百合LiliumpumilumDC.的干燥肉质鳞叶，具有养阴润肺，清心安神的功效，临床多用于阴虚燥咳，劳嗽咳血，虚烦惊悸，失眠多梦，精神恍惚[1]。百合药材中含有酚酸甘油酯、甾体皂苷、多糖、多酚、生物碱等多种类化学成分[2-7]，其中，酚酸甘油脂类成分具有抗肿瘤、抗氧化、抗增殖、免疫调节等药理作用[8-9]，王百合苷B为百合中主要的酚酸甘油脂类成分之一。

蜜百合为百合临床常用的主要炮制品之一，百合经蜜制后，能增强其润肺止咳的功效。《中国药典》2020年版收载蜜百合的炮制方法无具体的工艺参数规定，目前，蜜百合的实际加工生产中多凭老药工经验进行炮制，导致蜜百合批间质量差异较大，影响临床疗效。本试验以王百合苷B含量和蜜百合饮片性状为评价指标，采用响应曲面法对蜜百合的炮制工艺进行优化，以期为蜜百合的炮制工艺和质量的控制提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪 器

Thermo U3000型高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技公司；XPE26型电子分析天平，梅特勒-托利多；MS204S型电子分析天平，梅特勒-托利多；KQ-500DE型超声清洗机，昆山市超声仪器有限公司；CY25型中药炒药机，温州鼎力医疗器械有限公司。

1.2 试 剂

王百合苷B对照品(批号：230039-201901、纯度≥98%)，上海鸿永生物科技有限公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Inertsustain AQ C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；以乙腈-0.1%磷酸溶液(19∶81)为流动相等度洗脱，检测波长为312 nm；进样量10 μL，见图1。

图1 对照品王百合苷B(A)及蜜百合供试品(B)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of regaloside B (A)and sample solution of honey fried lily (B)

2.2 对照品溶液的制备

取王百合苷B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含120 μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末(过三号筛)1.0 g，精密称定，精密加入80%乙醇25 mL，称定重量，回流提取30 min，放冷，再称定重量，用80%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 蜜百合炮制工艺单因素考察

2.4.1 蜜水加入先后顺序的考察

取净百合饮片200 g，平行2份，一份置热锅内，用文火(锅温140 ℃)炒干，喷淋蜜水(炼蜜约10 g，炼蜜∶水=1∶4)；另一份淋入蜜水(炼蜜约10 g，炼蜜∶水=1∶4)，拌匀，闷透，置热锅内，用文火(140 ℃)炒至不粘手时，取出，晾凉。按照上述测定方法测定2份蜜百合中王百合苷B含量，结果前者含量为0.27%、后者含量为0.26%，表明两种方法所制得蜜百合饮片中王百合苷B含量基本一致，综合考虑炮制工艺的方便易操作性，选择先加蜜水后炒制的方法开展后续蜜百合炮制工艺研究。

2.4.2 蜜水比例的选择

取净百合饮片200 g，平行5份，加入炼蜜水(炼蜜约10 g)，其中炼蜜与水的比例分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6，拌匀，润透，置140 ℃的炒锅内炒至不粘手时，取出，晾凉。按照上述测定方法测定5份蜜百合中王百合苷B含量，结果见图2，表明随着蜜水比例的增加，蜜百合饮片中王百合苷B的含量呈现先增加后降低的趋势。同时，当炼蜜与水比例低于1∶4时，存在拌不匀、润不透现象，当高于1∶5时，又出现润制太过现象，综合王百合苷B和润制程度考虑，暂定蜜水比例为1∶4。

图2 不同蜜水比对王百合苷B含量的影响Fig.2 The effect of different ratio of honey and water on the content of regaloside B

2.4.3 炒制温度的选择

取净百合饮片200 g，平行5份，加入炼蜜水(炼蜜约10 g，炼蜜∶水=1∶4)，拌匀，润透，分别置于100 ℃、120 ℃、140 ℃、160 ℃、180 ℃的炒锅内炒至不粘手时，取出，晾凉。按照上述测定方法测定5份蜜百合中王百合苷B含量，结果见图3，表明随着炒制温度的增加，蜜百合饮片中王百合苷B的含量呈现先增加后降低的趋势。同时，在蜜炙过程中发现，当炒制温度过高时，可使蜜百合饮片表面变为红色，其中160 ℃炒制14 min，180 ℃炒制10 min均可致蜜百合饮片表面变为红色或红褐色。综合蜜百合饮片外观性状和王百合苷B含量结果，暂定蜜百合的炒制温度为140 ℃。

图3 不同炒制温度对王百合苷B含量的影响Fig.3 The effect of different frying temperature on the content of regaloside B

2.4.4 炒制时间的选择

取净百合饮片200 g，平行6份，加入炼蜜水(炼蜜约10 g，炼蜜∶水=1∶4)，拌匀，润透，置于140 ℃的炒锅内，分别炒制10 min、12 min、14 min、16 min、18 min、20 min，取出，晾凉。按照上述测定方法检测6份蜜百合饮片性状及王百合苷B含量，结果见表1。表明随着炒制时间的增加，蜜百合饮片中王百合苷B的含量先微增后降低，且随着炒制时间的增加，蜜百合饮片的颜色逐渐加深，从黄白色到红色。结合性状和王百合苷B含量，暂定蜜百合的最佳炒制时间为14 min。

表1 不同炒制时间蜜百合饮片检测结果Table 1 Results of honey fried lily at different frying time

2.5 响应面法优选蜜百合炮制工艺

2.5.1 试验设计

在单因素试验的基础上，优选蜜百合的最佳炮制工艺。采用Design Expert 12软件BoxBehnken试验的三因素三水平设计原理，以蜜水比(A)、炒制温度(B)、炒制时间(C)三个因素为自变量，以蜜百合中王百合苷B含量(X1)和性状(X2)的综合评分为因变量，采用加权评分法优选蜜百合的炮制工艺。设定满分为100，含量和性状权重系数均为0.5，综合评分(Y)=X1/X1max×50+X2/X2max×50。共设定17组试验点，因素水平见表2，试验结果见表3。

表2 响应曲面试验因素水平Table 2 Factor and level in response surface methodology

表3 响应曲面试验设计及结果Table 3 Response surface experiment design and results

以综合评分为效应值，通过Design Expert12软件对所得数据进行二次多项回归拟合分析，拟合出蜜水比(A)、炒制温度(B)、炒制时间(C)与综合评分(Y)的多项回归方程为Y=97.85-0.11A-3.56B-2.76C+1.67AB+7.06AC-3.71BC-6.65A2-8.64B2-5.05C2。该模型的方差分析结果及显著性检验见表4。

表4 响应曲面回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of response surface method regression model

由表4可知，本模型P<0.001，具有极显著性意义，结果中B、C为显著项，A为不显著项；在交互项中，AC为高度显著项，BC为显著项，AB为不显著项。总模型方程相关系数R2=0.9501，表明实验值与预测值有很好的拟合度，且失拟项不显著(P=0.1080)，表明其它因素对实验结果影响比较小，回归方程的模拟良好，实验误差相对较小。可采用该方法对百合的蜜炙工艺进行预测和分析。

2.5.2 响应曲面分析与优化

根据上述回归方程，绘制各影响因素交互作用的三维响应曲面图，见图4。响应面图的陡峭程度可直接反映各因素交互作用的强弱，C与A、B交互作用显著，曲面较陡，A与B交互作用较弱，曲面相对平缓。运用Design Expert 12软件求解回归方程，得到蜜百合的最佳炮制工艺为：蜜水比例为1∶3.77，炒制温度为137.08 ℃，炒制时间为12.49 min。考虑到实际可操作性及设备的控制精度，将工艺参数调整为蜜水比例为1∶3.8，炒制温度为137 ℃，炒制时间为12.5 min。

图4 影响因素与综合评分的响应面图Fig.4 Response surface diagram of influencing factors and comprehensive score

2.5.3 验证试验

取净百合饮片200 g，平行3份，按上述优化后的炮制工艺制备蜜百合，测得王百合苷B含量和性状的综合评分均值为98.45，与模型预测值98.65接近，表明该炮制工艺稳定可行。

3 讨论与分析

3.1 练蜜加入先后顺序考察

蜜炙时，通常有两种操作方法，即“药材先拌蜜后炒法”和“先炒药材后加入蜜法”，前者操作方便，适用范围较广，便于工业化生产，后者多适用于质地致密、坚硬，炼蜜不易被吸收的药材。通过研究发现两种方法均可制备蜜百合饮片，且两种方法制备的蜜百合饮片质量基本一致。

3.2 色谱条件的优化

本实验考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸-水、乙腈-磷酸-水等流动相系统，结果发现使用磷酸时王百合苷B色谱峰分离度、对称性均良好，且保留时间适中。通过紫外全波长扫描确定了王百合苷B在312 nm 处吸收较好，峰型适中，基线平稳，故确定检测波长为312 nm。通过流速(0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)、柱温(20 ℃、25 ℃、30 ℃)的考察，发现不同流速、不同柱温对王百合苷B色谱峰影响不大，故色谱条件中未对流速和柱温进行进一步规定。

3.3 蜜炙过程中王百合苷B含量变化

在蜜百合饮片炮制过程中，随着炒制温度的增加或炒制时间的延长，蜜百合中王百合苷B含量均存在先增加后降低的趋势。可能原因是在炮制适中情况下，蜜百合经加热炒制后有效成分更易溶出，使王百合苷B含量增加；当炮制太过情况下，因长时间高温炒制，导致王百合苷B成分分解而使之含量降低。

3.4 蜜百合炮制过程中的颜色变化

百合药材表面颜色为黄白色至淡棕黄色，经蜜炙后，蜜百合表面颜色加深，变为棕黄色，且偶见有焦斑。研究中发现，蜜炙时若炒制温度过高或炒制时间过长，蜜百合饮片表面均易变为红色至红褐色，可能是百合中的多酚类化学成分因高温或长时间加热发生了氧化反应。

4 结 论

本实验选择蜜百合饮片外在的性状和内在的含量作为评价指标，通过单因素试验、响应曲面法试验，量化了蜜百合饮片的炮制工艺参数，避免老药工经验炮制存在批间或每锅质量波动情况，保证了蜜百合饮片的质量和临床疗效的稳定。同时，也为蜜百合工业化、标准化生产提供科学依据。但中药化学成分复杂，活性单体成分众多，老中医多认为中药是“多成分多靶点协同起作用”，仅采用王百合苷B含量对百合整体质量进行评价是否合理，还需进一步研究。