半枝莲多糖不同给药方式对大鼠肝癌模型血管生成的影响

张玉穗,刘 嵘,丁 远

(贵州中医药大学第一附属医院放射科,贵州 贵阳 550000)

半枝莲为唇形科植物半枝莲的干燥全草,具清热解毒、散癖止血、利尿消肿之功效,近些年的研究发现其具有很好的抗肿瘤活性[1-3],已经成为国内外抗肿瘤中药研究的热点[4-5]。研究发现半枝莲的主要生物活性成分半枝莲多糖(Scutellaria barbata polysaccharides,SBPS)可以提升小鼠溶血素水平[6]并抑制小鼠体内肿瘤的生长[7]。肿瘤生长的过程需要汲取营养物质,故随着肿瘤体积的增大,肿瘤周边基质会形成新生血管[8],这种新生血管是肿瘤发生远处转移的重要通道[9-10]。因此,抑制血管生成一直都是对抗肿瘤的重要研究方向。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在肿瘤血管的发生和生长过程中具有极为重要的作用,血清VEGF的水平可以对肿瘤预后做出评估[11-12]。本研究基于大鼠肝癌细胞模型,以VEGF为指标观察半枝莲多糖对肿瘤组织中血管生成的影响,并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物和瘤株

研究选取4～6周龄Nu/Nu裸鼠24只,体重200g左右,购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。肝癌HepG2瘤株购自于中国医学科学院肿瘤研究所。

1.2 实验材料和试剂

半枝莲多糖为中药半枝莲饮片通过水煮醇沉方式获得的提取物,由本实验室提供,药材购买于购自宁波德康生物制品有限公司;反转录试剂盒购自GeneStar公司;注射用氨基甲酸购自上海儒吉生物科技发展有限公司;泛影葡胺购自上海旭东海普药业;高糖细胞培养液(DMEM)购自Gibco公司;庆大霉素购自西南药业股份有限公司;CD34购自Abcam公司;VEGF单克隆抗体购自Abcam公司(货号:ab68334);中杉金桥二步法免疫组化检测试剂盒(货号:K116812c);DAB显色试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1细胞培养

HepG2细胞加入10% FBS的DMEM的完全培养基,细胞汇合度达到80%时进行传代,备用。

1.3.2裸鼠肝细胞癌(HCC)模型的建立

将处于对数期的HepG2细胞稀释至2106 cells/mL,取250μL细胞悬液接种于大鼠皮下,待皮下瘤长至直径5～6mm时取下作为瘤源。裸鼠用200g/L乌拉坦注射腹腔进行麻醉,左上腹肋缘下斜切口长约6～8cm,暴露肝脏左叶,用尖镊在肝左叶最厚区域刺破肝被膜,棉签轻压刺破口,再用尖镊准确送入1～2块瘤组织,观察无出血后,全层关腹。原位种植后的7、14、21、28和35天进行CT扫描,观察肿瘤生长状态。

1.3.3裸鼠经肝动脉化疗栓塞术(TACE)模型的建立

选取荷瘤模型成功且状态良好的HepG2-luc大鼠,用200g/L乌拉坦腹腔麻醉,切开皮肤,充分暴露腹腔,在DSA监控下,借助于超滑导丝引导,将2F硅胶管经胃十二指肠动脉超选择逆行插管至肝左动脉,注入200μL 76%泛影葡胺,减影确认后,经肝动脉行灌注化疗术。术毕,拔出导管,结扎胃十二指肠动脉,同时腹腔内注射含庆大霉素8万单位的生理盐水,逐层关腹。

1.3.4裸鼠体内给药

选取荷瘤模型成功且状态良好的HCC裸鼠24只,随机分为:口服半枝莲多糖组、经肝动脉注射半枝莲多糖组、对照组,每组8只。其中前两组每次给药100mg/kg,共给药3次,每次间隔1周;对照组按照同样的处理给予同体积的生理盐水。

1.3.5荷瘤鼠抑瘤率的影响分析

末次给药24h后,颈椎脱臼处理大鼠,常规方法称取实体瘤重量,计算半枝莲多糖抑制荷瘤鼠肿瘤生长的百分率(抑瘤率)。抑瘤率=(对照组平均瘤重-口服或经肝动脉注射半枝莲多糖组平均瘤重)/对照组平均瘤重100%。

1.3.6微血管密度(Microvessels Density,MVD)测定

将大鼠肿瘤组织剥离,放入10%中性甲醛进行固定,进行石蜡包埋并切片,选择小鼠CD34单克隆抗体(1:10)作为一抗进行免疫组化检测与分析。首先于低倍镜下扫描切片,定位MVD高密度区域,再于400倍视野下定位于肿瘤中心并对肿瘤边缘的微血管数目进行计数,每个样本随机统计5个不同的视野区域,计算样本MVD平均值。

1.3.7qPCR检测VEGF

提取各组大鼠肿瘤组织样品,Trizo法提取组织样本RNA,按照GeneStar 反转录试剂盒进行cDNA链的合成,随后按照CORNING公司SYBR Green Mix定量试剂盒进行qPCR反应检测VEGF表达量,引物序列为F:5’-TTGCCTTGCTGCTCTACCTCCA,R:5’-GATGGCAGTAGCTGCGCTGATA。同时以NADPH为内参对照,引物序列为F:5’-GCCAGAGTATCACTACCTCCAC, R:5’-CTCGGAGGTAAGCCAAGAGTGT。

1.3.8Western Blot检测VEGF表达量

液氮研磨大鼠肿瘤组织样本,匀浆器匀浆,取适量加入100μLPBS重悬,然后加入25μL 5蛋白上样缓冲液,混匀,沸水中作用10min,制备蛋白样品进行SDS-PAGE,然后利用湿转法将蛋白转至平PVDF膜,用5%脱脂奶粉封闭1h,一抗小鼠VEGF单克隆抗体(1:2000),4℃孵育过夜,TBST清洗5次,每次5min,然后与HRP标记的兔抗鼠IgG(1:5000稀释)作用1h,TBST清洗5次,每次5min,然后ECL显色。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 半枝莲多糖不同给药方式对HCC裸鼠瘤重的影响

给药组降低肿瘤重量指标高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。其中,肝动脉灌注给药组较口服组抑瘤率更加明显,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

图1 各组大鼠平均瘤重注:与模型对照组相比,***P<0.001,*P<0.05;与口服组相比,##P<0.01。

2.2 qPCR检测肿瘤组织VEGF表达量

分别取各组肿瘤组织,液氮研磨提取RNA,反转制备cDNA,以此为模板检测VEGF表达量,结果显示如图2。对照组VEGF mRNA水平高于给药组,差异有统计学意义(P<0.05);且口服组和肝动脉灌注组比较结果发现,前者VEGF mRNA水平高于后者,差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 各组肝癌组织中VEGF的mRNA的相对表达量注:与模型对照组相比,***P<0.001,**P<0.01;与口服组相比,##P<0.01。

2.3 Western blot 检测各组肿瘤VEGF表达量

蛋白免疫印迹显示对照组VEGF蛋白表达量显著高于给药组,差异有统计学意义(P<0.05);口服组和肝动脉灌注组比较结果发现,前者VEGF 蛋白表达量显著高于后者,差异有统计学意义(P<0.05)。详见图3。

图3 各组肝癌组织中VEGF蛋白表达水平注:与对照组相比,***P<0.001,*P<0.05;与口组相比,##P<0.01。

2.4 半枝莲多糖对MVD的影响

对照组组织中MVD的平均值为(13.62±3.12)个/视野,肝动脉灌注组大鼠MVD的平均值为(7.45±1.52)个/视野,口服组MVD的平均值为(11.16±2.34)个/视野。统计学分析显示,较对照组,经肝动脉灌注半枝莲多糖可显著抑制肝癌组织中微血管的形成(P<0.05)。详见图4。

图4 三组肝癌组织中MVD数量分析上图为癌症样本组织化学分析,箭头指示CD34阳性的微血管,400倍视野下微血管密度计数;下图为肿瘤中MVD的量化分析。注:肝动脉灌注组与对照组相比,*P<0.05。

3 讨论

目前,原发性肝癌是目前发病率最高的恶性肿瘤之一,在全球恶性肿瘤发病率中排第6位,其引发的死亡在肿瘤致死率中排第3位[13-14]。绝大多数肝癌血供丰富,恶质病、转移率高、切除复发性高等因素是影响其预后的重要原因[15-16]。肝癌组织的血管是癌细胞进行代谢的重要结构基础,抑制血管生成相关因子如bFGF、VEGF,可以直接有效地抑制肿瘤血管的生成进而抑制肿瘤的生长,因此抑制肝癌血管生长是目前临床治疗肝癌的重要干预手段[17-18]。VEGF在增加肿瘤血管通透性、促进血管生长中具有关键性作用,故目前针对VEGF及其受体开发的药物,如贝伐珠单抗、索拉非尼等在肝癌临床治疗中取得了重要应用[19]。

多糖是自然界常见的天然大分子药物,不断的研究发现多糖在抗肿瘤中起到了重要作用[20]。半枝莲多糖是中药半枝莲的重要生物活性物质之一。张秀娟团队发现半枝莲多糖可以显著抑制S180肉瘤在体内的生长[21],随后有报道称半枝莲多糖可以抑制大鼠HepA肿瘤的生长,增强大鼠机体免疫机能[22]。于水澜等人通过分析半枝莲多糖干预对肝癌大鼠差异表达蛋白质的影响,结果发现其可以调节肝癌血清中多蛋白调节实现对肿瘤生长的抑制[23]。但是目前,对于半枝莲多糖对肝癌血管组织血管生长的影响还未见报道。

本研究通过建立裸鼠HCC模型,分别给予口服和肝动脉灌注的方法给予半枝莲多糖治疗,随后对其抑瘤率、VEGF表达、肝癌组织MVD的影响进行分析。结果发现半枝莲多糖可以显著抑制裸鼠肝癌组织的生长,其中肝动脉灌注比口服取得的抑瘤效果更加明显。VEGF的mRNA和蛋白表达水平检测发现半枝莲多糖能够显著降低VEGF在肿瘤组织中的表达,而且肝动脉灌注取的效果更加明显。为了更加直观的展示半枝莲对肿瘤组织血管生成的影响,我们进行了免疫组织化学检测,结果发现肝动脉灌注半枝莲多糖的方法取得了最佳的血管抑制效果,虽然口服半枝莲多糖相比于对照组微血管密度有所降低,但是差异不显著,该结果和之前的检测基本吻合。

综上所述半枝莲多糖可以有效抑制肝脏组织中VEGF的表达,从而抑制肝癌组织中微血管的生成,继而实现抑制肝癌的效果。肝动脉灌注半枝莲多糖相比于口服能够达到更佳的治疗效果,为半枝莲多糖在肝癌临床的治疗提供参考。