Kisspeptin在辅助生殖过程中的研究进展

孙轶群，赵军招

温州医科大学附属第二医院 生殖医学中心，浙江 温州 325000

随着女性生育年龄普遍推迟，女性不孕症日益增多，越来越成为重要的社会问题。研究[1]表明世界上大约15%的人受到不孕不育的影响，辅助生殖技术（assisted reproductive technology,ART）的发展为解决这一问题提供了重要途径，也要求我们对生殖过程有更加深入的研究以及更加精细的把控。ART主要包括体外受精（in vitro fertilization,IVF）与胚胎移植等过程，卵子的成熟、排卵以及胚胎着床都是其中的重要环节。临床研究表明，kisspeptin作为下丘脑-垂体-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG）轴的上游因素，通过调节GnRH分泌促进卵子成熟，诱发排卵[2]，而局部作用在卵巢的kisspeptin也对卵子的成熟及排出起促进作用[3]。此外，子宫内膜和胚泡中局部表达的kisspeptin/KISS1R在母胎界面参与多种生理活动，在着床的过程中也发挥着重要作用[4]。本文对kisspeptin在辅助生殖领域的相关研究进行综述，以探寻其临床应用价值。

1 KISS1/KISS1R 系统概述

Kisspeptin以及它的编码基因KISS1 是由LEE等[5]于1996年在研究黑色素瘤转移的过程中发现并命名。而后LEE等[6]又在大鼠脑中发现一种G蛋白偶联受体，命名为GPR54。2001年，OHTAKI等[7]证实了GPR54为kisspeptin的受体，此后GPR54又名为KISS1R。此外，多个研究小组在研究不同生理功能时独立发现了KISS1R的存在，使KISS1R还有其他不同的名称，包括AXOR12、CPPB1、hOT7T175和HH8[8-10]。2003年，SEMINARA等[11]发现GPR54突变导致人类和小鼠单纯性促性腺激素功能减退症（idiopathic hypogonadotropic hypogonadism,IHH），使人们开始认识到kisspeptin/KISS1R系统在HPG轴中起到重要作用，促进生殖领域对kisspeptin开展系列研究。研究[12]发现KISS1基因位于人染色体1q32上，编码一个无生物学活性且不稳定的145氨基酸前肽，可以裂解成四种活性短肽，以氨基酸数量分为kisspeptin-10、13、14和54，其中kisspeptin-54又可以进一步裂解kisspeptin-10、13、14，这些不同的亚型统称为kisspeptins。短肽kisspeptins均含有一个活性Arg-Phe-NH2序列的C端区域，具有高亲和力，能够结合并完全激活KISS1R，从而进一步发挥生理作用[13]。

2 Kisspeptin促进卵细胞成熟及诱导排卵

2.1 Kisspeptin神经元的中枢调控 Kisspeptin神经元位于下丘脑前腹侧室旁核（anteroventral periventricular nucleus,AVPV）和弓状核（arcuate nucleus,ARC），后者的kisspeptin神经元除了表达kisspeptin外，还表达神经激肽B（neurokinin B,NKB）和强啡肽（dynorphin,Dyn）两种神经肽，也被称作kisspeptin/神经激肽B/强啡肽（kisspeptin/NKB/Dyn,KNDy）神经元[14]，它们通过调控促性腺激素释放激素（gonadotropin releasing hormone,GnRH）神经元脉冲的频率和幅度调控垂体黄体生成素（luteinizing hormone,LH）和促卵泡生成素（follicle stimulating hormone,FSH）的分泌，见图1。Kisspeptin神经元增加GnRH脉冲的幅度，优先刺激LH的分泌，KNDy神经元上的Dyn则降低GnRH脉冲的频率，优先刺激FSH的分泌[15]。此外，AVPV的kisspeptin神经元主要接受雌激素的正反馈，ARC的KNDy神经元则接受雌激素的负反馈[16]。在卵泡发育的初始阶段，雌激素水平低下，刺激ARC的KNDy神经元，kisspeptin、NKB、Dyn分泌增加，引起低频率的GnRH脉冲，使FSH分泌增加，刺激卵泡的募集和生长。随着卵泡的生长，雌激素的分泌逐渐增加，负反馈作用使KNDy神经元活性下调，GnRH脉冲频率增加，导致LH分泌开始增加，FSH的分泌逐渐减少。到排卵前阶段时，AVPV的kisspeptin神经元接受雌激素的正反馈信号，产生高幅度的GnRH脉冲，在高频率和高幅度的GnRH脉冲下，LH激增，从而引发排卵[15]。

图1 下丘脑中kisspeptin神经元对下丘脑-垂体-性腺轴的调控作用

YEO等[17]利用转基因小鼠进行病毒示踪，发现大脑多个区域显示与KISS1 神经元的突触连通性，包括视上核和视交叉中的加压素神经元，室旁核中促甲状腺激素释放的神经元和其他区域的神经元，例如杏仁核、纹状体、大脑皮层的视觉、触觉、嗅觉区等。许多研究[18-20]也证明kisspeptin在大脑其他区域发挥着重要作用，例如杏仁核内的kisspeptin神经元，也可以调节下丘脑GnRH脉冲发生器频率，在杏仁背内侧核内注射kisspeptin将导致LH分泌增加。kisspeptin在生殖神经内分泌中有复杂的网络与作用机制，其具体通路以及将来的应用有待进一步研究与发掘。

2.2 Kisspeptin局部作用于卵巢 JAYASENA等[21]对53名妇女进行单次皮下注射kisspeptin-54，36 h后取卵评估成熟度，发现注射kisspeptin-54 能促进卵子成熟，且患者的平均成熟卵数以剂量依赖性方式增加。鉴于kisspeptin-54能够穿过血脑屏障，刺激LH释放到外周循环，但是提高的LH水平也可以诱导卵母细胞成熟，尚不能说明kisspeptin可以直接作用于卵巢诱导卵母细胞成熟。但有研究[22-25]表明了kisspeptin在大鼠、小鼠、绵羊、猪、犬、牛、人类等哺乳动物卵巢组织中表达，揭示了kisspeptin在卵巢组织中的局部功能。HU等[3]更是进一步综述了kisspeptin在直接控制卵泡发育，卵母细胞成熟，类固醇生成和排卵中的作用。由此可见，无论是对于HPG轴的中枢调控，还是对于卵巢的局部作用，kisspeptin在哺乳动物卵子成熟及排卵方面都有着积极作用，这也为其在促进排卵方面的应用提供理论基础。

2.3 Kisspeptin作为促排卵药物的应用 动物实验和临床研究均证实了外源性kisspeptin可作为触发卵母细胞成熟的新型替代方法，其有效性并不弱于传统的β-人绒毛膜促性腺激素（human choionic gonadotophin,HCG）和GnRH激动剂，且在卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS）高风险患者中应用更为安全[26]。OHSS是诱发排卵过程中较常见的并发症，主要与IVF治疗期间用于诱导卵母细胞成熟的激素有关。ZHAI等[27]研究发现kisspeptin-10 通过激活KISS1R和抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）来防止OHSS患者血管通透性增加。ABBARA等[28]通过对照实验发现对于OHSS高风险女性，kisepteptin-54 可以延长LH的作用时间，提高卵母细胞的成熟度的同时并不增加OHSS的发生率，可见kisspeptin作为新型触发卵母细胞成熟的治疗剂，让OHSS高风险女性也能实现胚胎移植。ABBARA等[29]又进行了一项回顾性队列研究，发现在OHSS高风险女性中，通过kisspeptin诱导GnRH释放来触发卵母细胞成熟，较外源性HCG更有优势。OWENS等[30]研究也发现，与HCG相比kisspeptin给药后所观察到的血清促性腺激素的分布与自然周期更为相似。综合上述研究，kisspeptin作为一个促进卵母细胞成熟的制剂在临床上应用前景广阔，特别是对于OHSS高风险女性而言，可以显著提高安全性。然而，还需要进一步的实验来确定kisspeptin的临床效用，比较kisspeptin和当前诱导卵母细胞成熟模式的优劣，探寻卵子成熟的最佳触发机制，优化IVF治疗的妊娠结局。

3 Kisspeptin调控胚胎着床

在哺乳动物着床和胎盘发育过程中，kisspeptin/KISS1R系统在母胎界面表达，通过多种信号通路在子宫和胎盘中参与各种生理活动[31-32]。母胎界面是母体与胎儿直接交流的界面，主要由胎儿侧的滋养层细胞及母体侧的蜕膜细胞共同构成。胚胎着床在母胎界面发生，当调节胚胎生长分化和调节子宫内膜容受性的分子程序实现同步，胚泡在短暂的植入窗口期内与子宫内膜贴附，随后滋养层细胞侵入内膜，与蜕膜化的子宫内膜共同组成胎盘，维持胚胎进一步发育[33]。

3.1 Kisspeptin在滋养层细胞中的作用

3.1.1 黏附作用：早期研究[34]表明，KISS1 和KISS1R在女性胎盘早期表达最高，随后逐步建立了KISS1 参与早期滋养层着床的概念。KISS1 的表达局限于绒毛滋养细胞，而KISS1R的表达同时存在于绒毛滋养细胞和绒毛外滋养细胞，提示KISS1可能通过自分泌和旁分泌的方式在植入早期发挥作用[35]。TAYLOR等[36]发现kisspeptin以剂量和时间依赖性诱导人绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast cells,EVT）对I型胶原蛋白（人胎盘的主要成分）的黏附，这种黏附作用可能通过激活PKC和ERK途径而发生，且抑制PKC和ERK1/2减弱了kisspeptin诱导的EVT黏附性。此外，BABWAH等[37]发现kisspeptin可增加小鼠胚胎对胶原蛋白I的黏附力，表明kisspeptin信号传导是着床早期胎盘滋养细胞黏附作用的关键调节剂。

3.1.2 调控侵袭：滋养细胞的侵袭和癌细胞的侵袭极为相似，包括增加细胞增殖，减少细胞凋亡，增加血液供应以及局部组织的侵袭[38]。绒毛外滋养细胞过度侵袭会导致胎盘植入，造成不良妊娠结局。因此，精确调控绒毛外滋养层细胞侵袭子宫内膜是成功着床的关键。Kisspeptin已被证明可以抑制癌细胞转移，基于此，FRANCIS等[39]从人妊娠早期胎盘中分离到滋养细胞，在划痕迁移实验中证明kisspeptin降低了滋养细胞的迁移能力。RT-PCR结果显示kisspeptin处理降低了基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）1、2、3、7、9、10、14和VEGF-A的表达，增加了MMPs抑制剂1和3的表达。MMPs主要通过降解细胞外基质中的多种蛋白，进而破坏细胞侵袭的组织学屏障，在细胞侵袭转移中起关键作用[40]。VEGF-A促进侵袭过程中血管内皮细胞的生成，抑制子宫螺旋动脉的栓塞与重塑[41]，表明kisspeptin可以通过抑制细胞迁移、降低MMPs和VEGF-A表达来抑制早期妊娠滋养细胞的过度侵袭。

3.2 Kisspeptin在子宫内膜细胞中的作用 胚胎植入需要胚胎与子宫内膜之间的精密对话，使子宫内膜免于普通月经周期的脱落，增生并分化为一种特殊的蜕膜组织，该过程称为子宫内膜蜕膜化[42]。蜕膜化过程中，子宫内膜间质细胞发生蜕膜化反应，增殖并分化为上皮样细胞，从而形成母体蜕膜。蜕膜化后的子宫内膜基质细胞具有调节滋养细胞侵袭，抵抗炎症反应和氧化损伤以及抑制母体局部免疫反应的独特能力，对于妊娠的建立以及维持具有重要作用。

3.2.1 促进内膜基质细胞蜕膜化：ZHANG等[31]采用qPCR动态检测小鼠KISS1/KISS1R水平，发现KISS1和KISS1R的mRNA及蛋白水平在妊娠早期小鼠子宫内膜基质细胞动态增加，并在体内诱导蜕膜化。此外，在体外基质细胞培养模型中，KISS1和KISS1R mRNA的表达也随着基质细胞蜕膜化的进展逐渐升高，使用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）使KISS1的表达减弱则显著阻断了基质细胞蜕膜化的过程，证明了KISS1/KISS1R系统参与小鼠早孕期子宫蜕膜的形成。BABA等[43]将人子宫内膜基质细胞体外原代培养，证明了人基质细胞体外蜕膜过程中kisspeptin的表达增加。肖伊[44]进一步开展体外人子宫内膜基质细胞蜕膜化实验，发现随着蜕膜化进展，kisspeptin干预组蜕膜化标志物胰岛素样生长因子结合蛋白1（insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP-1）及催乳素（prolactin,PRL）表达均升高，而siRNA抑制KISS1表达后蜕膜化标志物下调。以上研究表明kisspeptin在小鼠和人基质细胞表达且对子宫蜕膜化有促进作用。

3.2.2 促进内膜腺上皮细胞协调作用：Forkhead box A2（FOXA2）条件性缺失使小鼠子宫腺上皮细胞缺乏白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF），胚胎植入失败，进而导致小鼠不孕[45]。KELLEHER等[46]采用FOXA2缺陷小鼠模型，揭示子宫内膜腺上皮细胞同步胚胎-子宫内膜间的相互作用，通过腺上皮细胞分泌的LIF启动胚胎-子宫通讯，协调胚胎植入时机，并影响基质细胞蜕膜化，从而实现胚胎顺利着床。CALDER等[47]建立KISS1（-/-）小鼠模型，发现着床时LIF在腺上皮细胞中微弱表达，给予外源性LIF后部分挽救了小鼠胚胎着床。表明了kisspeptin是LIF的上游调控因子，通过上调腺上皮细胞中LIF促进胚胎的植入过程。

在胚胎着床的过程中，kisspeptin在胚胎和母体双方均有表达，且通过不同的信号通路调节细胞黏附分子、MMPs、VEGF-A、LIF等下游信号，增强胚胎对子宫内膜的黏附作用、抑制绒毛外滋养层细胞过度侵袭、促进子宫内膜基质细胞蜕膜化、协调胚胎-子宫内膜间的相互作用，在植入过程中发挥着重要作用。

4 Kisspeptin预测妊娠结局

4.1 宫内妊娠与流产 澳大利亚的一项横断面研究，共纳入176名育龄期女性，将HCG日的血清kisspeptin水平与胞浆内精子注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）后的妊娠结局相联系，发现血清kisspeptin水平与妊娠HCG阳性独立相关[48]，表明HCG日测量的kisspeptin可作为ICSI后女性治疗成功的标志。另有一项病例对照研究将胎龄为6～10 周宫内妊娠（IUP组）、胎龄为6～10 周自然流产（SAB组）和未妊娠的妇女进行比较，发现妊娠组（IUP及SAB组）kisspeptin水平高于未妊娠组，IUP组的kisspeptin水平高于SAB组，表明血清kisspeptin水平能用于鉴别SAB与IUP，预估妊娠结局[49]。HU等[50]及ABBARA等[51]研究均验证了血清kisspeptin水平在妊娠和非妊娠状态以及持续妊娠和流产中存在差异，kisspeptin水平与胎龄呈正相关，流产患者血清kisspeptin水平与HCG值正相关。YUKSEL等[52]的研究也表明正常妊娠患者在妊娠早期的血清kisspeptin水平高于异位妊娠患者和流产患者。SILVA等[53]将7项病例对照研究进行系统回顾，综述了kisspeptin预测早期妊娠存活的潜在作用。综合上述研究，kisspeptin在预测妊娠结局方面具有潜在临床应用价值，kisspeptin水平较高预示着相对较优的妊娠结局。

4.2 复发性流产（recurrent spontaneous abortion,RSA）RSA是指连续2次或2次以上的自然流产，流产多发生在妊娠早期，发病率占总妊娠数的1%～5%[54]，再次妊娠发生流产的可能性高达30%～40%[55]。WU等[56]收集了32例RSA妇女和35例自愿流产妇女的滋养层和蜕膜组织，通过免疫组化检测kisspeptin、KISS1R的表达，发现RSA女性滋养细胞中kisspeptin、KISS1R表达均低于对照组（P＜0.05）。RSA女性蜕膜组织中kisspeptin表达低于对照组（P＜0.01），KISS1R表达无差异。表明kisspeptin在滋养层和蜕膜中的表达降低可能与RSA的发生相关联。LI等[57]比较了RSA患者和正常妊娠患者母胎界面kisspeptin/KISS1R的表达，发现RSA患者表达水平较低（P＜0.001）。MENG等[58]检测KISS1基因中错义单核苷酸多态性（SNPs），显示rs12998 G＞A和rs4889 C＞KISS1的G变异与不明原因的RSA有关，可能是该疾病的危险因素。以上研究均表明kisspeptin水平与RSA相关，kisspeptin的降低可能是发生RSA的重要原因。由此设想，外源性kisspeptin治疗可能可以通过改善RSA患者母胎界面滋养层和蜕膜组织的结构与功能，最终提高妊娠率。

4.3 反复移植失败（recurrent implantation failure,RIF）RIF指移植≥3次，优质胚胎或多次移植胚胎数量≥10 枚，仍然未能临床妊娠[59]，是IVF治疗后胚胎移植反复不着床的结果。杨贺佳[60]对比RIF患者与正常妇女不同子宫内膜周期KISS1/KISS1R基因的表达，发现增生期RIF组KISS1的mRNA的表达显著低于对照组，分泌期RIF组KISS1R的mRNA的表达显著低于对照组，表明RIF患者反复移植失败可能与其子宫内膜KISS1/KISS1R信号通路异常相关。邢晶晶[61]用RT-PCR检测kisspeptin、KISS1R在正常妊娠女性和RIF患者植入窗期子宫内膜上的表达和定位，发现kisspeptin、KISS1R在RIF患者植入窗期子宫内膜中表达下降，可能也参与RIF患者子宫内膜容受性的改变。由此推测，适当提高RIF患者子宫内膜KISS1/KISS1R的表达可能可以改善RIF患者子宫内膜容受性，提高患者胚胎移植成功率。当然，对于RIF患者具体发病机制及其与KISS1/KISS1R系统的相关关系有待进一步研究与明确。

5 结论与展望

中枢性kisspeptin在调控女性生殖生理过程发挥重要作用，除下丘脑之外，大脑多个区域中kisspeptin的价值也有待进一步发掘。卵巢局部表达的kisspeptin对于卵细胞成熟及排卵过程也存在重要影响。临床上kisspeptin在IVF周期中作为“扳机”药物的有效性和安全性均得到了初步证实，尚需更多的临床试验验证其机制与制剂用法用量。而在滋养细胞和子宫内膜等局部细胞和组织中的kisspeptin系统则通过多种信号通路，增加胚胎对子宫内膜的黏附、抑制绒毛外滋养层细胞过度侵袭、促进子宫内膜基质细胞蜕膜化、协调胚胎-子宫内膜间的相互作用从而促进胚胎的植入过程。血清kisspeptin水平还可以作为早期妊娠存活率生物标志物，预测IVF的最终结局。基于kisspeptin途径的药物在IVF治疗中将得到广泛应用。

有研究[4，52，62-64]表明kisspeptin水平还与多囊卵巢综合征，多胎妊娠、异位妊娠、妊高症、妊娠期糖尿病、妊娠滋养细胞瘤等妊娠相关疾病相关联，除此之外，kisspeptin在诊断和治疗OHSS、RSA、RIF等疾病中具有重要作用。相关制剂在评估和治疗生殖系统疾病方面也具有巨大潜力，kisspeptin在生殖医学领域将有着更广阔的应用。