粒径均一纳米囊泡结构的制备及性能研究

2023-10-08杨凯翟燕

山东化工 2023年16期

杨凯,翟燕

(太原工业学院材料工程系,山西太原 030008)

通过两亲性分子自组装制备的纳米结构材料在分子生物学、医学及生物材料领域展现出巨大的应用潜能[1-2]。两亲性分子中的亲水性和疏水性结构单元与介质环境相互作用,使得两亲性分子能够在选择性溶剂中发生自组装形成不同形貌的纳米结构,常见的纳米结构有球形胶束、纳米管和纳米囊泡等[3]。在生物体中,各种生物大分子,如蛋白质和磷脂,通过分子间或分子内的相互作用,可以自发组装成囊泡或囊泡类结构[4-6]。生物体内的这些囊泡类结构在细胞之间的信号传输及能量物质传递方面扮演着重要的角色,例如血液中的胰岛素就是以囊泡包裹的形式穿过细胞膜进入组织细胞中并发挥效用[7]。因此,可以将纳米囊泡结构被用作药物或者基因载体,在药物输送及基因工程领域充分发挥生物学应用价值[8-9]。

两亲性聚合物自组装制备的囊泡结构由于在生理条件下能够更稳定存在,可以被用作药物载体用于药物输送。同济大学李永勇教授课题组,将三嵌段共聚物PzLL-SS-PEG-SS-PzLL在水溶液中自组装制备的囊泡结构用于盐酸阿霉素(DOX·HCl)的负载运输[10];苏州大学孟凤华教授课题组,将三嵌段共聚物PEG-PAA-PDEA组装制备的囊泡用于细胞内蛋白质传递,诱导癌细胞凋亡[11]。能够对外部刺激做出响应,进而发生形貌改变的纳米囊泡载体可以实现负载药物的可控释放,提高治疗效率,进一步拓宽了其在病毒杀死和疾病治疗等领域的应用范围。浙江大学俞豪杰教授课题组,将硝基氧自由基引入到两亲性聚合物HLT中,组装制备囊泡结构后将其用于氟美松(DEX)的输送,负载药物后的囊泡结构在抗坏血酸存在的条件下能够自发解散并释放药物,展现出良好的还原刺激响应特性[12]。苏州大学钟志远教授课题组,利用所合成的两亲性共聚物PEG-PTMBPTC组装制备了对环境pH值能够做出刺激响应的囊泡结构,并将其用于紫杉醇(PTX)的包覆运输,由于聚合物分子链中存在的环苄基缩醛基团在弱酸性pH值下能发生快速水解,导致囊泡聚集体的膨胀和散解,从而实现负载药物的可控释放[13]。除此之外,能够对其他外部环境,如光、氧化还原、温度等刺激做出响应的药物运载体的研究也被持续报道[14]。纳米囊泡的药物负载量与粒径分布存在密切关系,粒径分布越窄,药物负载量越高。同时,囊泡结构的尺寸大小也会影响药物载体的输送效率,例如粒径尺寸在200 nm左右的囊泡结构能够选择性地穿透肿瘤部位的毛细血管壁到达病灶[15]。目前,粒径大小可控、分布均一,同时在水溶液中能够稳定分散的纳米囊泡结构的制备还存在诸多挑战[16-17]。同时,现有报道中用于药物输送的纳米囊泡结构多是通过嵌段共聚物在水溶液中自组装制备。嵌段共聚物的合成路线冗长、步骤繁琐,往往涉及不同嵌段的顺序共聚及接枝、取代、水解和“点击”反应等步骤[18-19]。相对于嵌段共聚物,无规共聚物的制备过程简单,通常是通过两种或多种不同单体一步共聚制备合成。因此,利用无规共聚物自组装制备能够稳定在水溶液中分散、粒径大小分布均一的纳米囊泡结构在生物医学领域更具实际意义。

采用ATRP反应仅一步成功制备了无规共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA),通过无规共聚物在水中自组装制备了能够稳定在水溶液中分散、粒径大小分布均一、对pH值具有刺激响应的囊泡结构。通过核磁共振氢谱(1H NMR)和傅里叶红外光谱(FT-IR)对聚合物的分子结构进行了表征,通过凝胶渗透色谱(GPC)对聚合物的分子量大小及分布进行了表征,通过透射电镜(TEM)和动态光散射光谱(DLS)对囊泡结构的形貌、粒径大小及分布进行了表征,并对所制备囊泡结构的pH值刺激响应特性进行了评价。结果表明,无规共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)成功制备,分子量大小为10 600,分子量分布指数(Mw/Mn)为1.20;在水中自组装后的形貌为囊泡结构,囊泡的粒径大小为(220±10)nm、大小分布均一、分散性稳定性良好;囊泡结构表面的zeta电位值为(32.6±0.8)mV。这些优异的特性使得所制备的新型纳米囊泡结构可以被用作药物或者基因载体,在药物输送、靶向释放及基因工程领域具有巨大的应用价值。

1 仪器与材料

1.1 实验材料

聚乙二醇单甲醚(mPEG,平均分子量5 000,aladdin),2-溴异丁酰溴(质量分数98%,aladdin),甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEAEMA,质量分数99.8%,aladdin),甲基丙烯酸2,2,3,4,4,4-六氟丁酯(HFBMA,质量分数99.8%,aladdin),五甲基二乙烯三胺(PMDETA,质量分数99.8%,aladdin),溴化亚铜(CuBr,质量分数99.8%,aladdin),三氯甲烷(分析纯,天津大茂化学试剂厂)。

1.2 测试仪器

傅立叶变换红外光谱(VERTEX 70,德国布鲁克公司),400 M核磁共振波谱仪(AVANCE III HD,德国布鲁克公司),马尔文激光粒度仪(Mastersizer 3000,英国马尔文仪器有限公司),凝胶渗透色谱仪(Waters 1515,美国沃特世有限公司),透射电子显微镜(JEM-2100F,日本电子株式会社)。

1.3 大分子引发剂mPEG-Br的合成

参照参考文献报道的合成方法来合成大分子引发剂mPEG-Br[20-23]。首先,将三乙胺和二氯甲烷干燥。将mPEG(Mn=5 000 g/mol,22.0 g,4.4 mmol)和三乙胺(1.5 mL,10.8 mmol)溶解在200 mL二氯甲烷中。将混合溶液在冰浴中冷却,向混合溶液中滴加溶解在15 mL二氯甲烷中的2-溴异丁酰溴(1.5 mL,14.3 mmol),并在2 h内滴加完毕。随后升温25 ℃,搅拌12 h。反应完毕后,过滤除去反应生成的盐。所得滤液依次用1 mol/L HCl,1 mol/L NaOH和去离子水洗涤。用硫酸镁干燥后,将滤液滴加到过量的冰冷乙醚中沉出,室温下真空干燥12 h,得到白色固体mPEG-Br。

1.4 无规共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的合成

将大分子引发剂mPEG-Br(1.00 g,0.2 mmol),DEAEMA(0.56 g,3.0 mmol),HFBMA(0.18 g,0.72 mmol)和三氯甲烷(5 mL)的混合溶液加入到装有磁力搅拌棒的25 mL Schlenk烧瓶中,并通过三次冷冻抽气-解冻循环。反应混合物在液氮中保持冷冻的状态下依次将PMDETA(0.35 g,0.2 mmol)和CuBr(0.29 g,0.2 mmol)快速加入烧瓶中,随后立即将烧瓶中充入氩气。烧瓶密封后,进行三次抽脱气循环。然后将烧瓶浸入60 ℃的水浴,4 h后将反应物通入空气并加入THF终止反应。旋蒸除去大量溶剂,将所得蓝色粗产物通过硅胶层析柱进行纯化,其中二氯甲烷作为淋洗液。将所得产物溶液浓缩并在正己烷中沉淀析出,将粗产物在真空干燥箱中干燥24 h。

1.5 无规共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的自组装

将25.0 mg无规共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)溶于1 mL 四氢呋喃溶液中,充分搅拌混合0.5 h。随后将混合溶液装入透析袋(7 000 Da)在去离子水溶液中透析6 h,通过各嵌段亲疏水作用引导无规共聚物进行自组装。然后,将所得溶液在5 000 r/min下离心5 min,收集上层溶液后并重新分散在5 mL去离子水中。

2 结果与讨论

2.1 mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)分子结构表征

图1(a)是无规共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的完整合成路线。图1(b)和图1(c)分别是无规共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的FT-IR和1H NMR谱图。如图1(b)所示,波数在2 987 cm-1处的吸收带是共聚物结构中-CH3的不对称伸缩振动吸收峰;波数在1 747,1 481(1 454),1 406(1 380),1 188 cm-1和1 107 cm-1处的吸收带分别是聚合物链段P(DEAEMA-r-HFBMA)结构中C=O的伸缩振动峰、-C(F)3的两个特征振动吸收峰、-C(F)2-的两个特征振动吸收峰、-C-F的特征振动吸收峰和-C-N振动吸收峰;波数在1 287 cm-1处的吸收带是聚合物链段mPEG结构中-C-O-C-的伸缩振动吸收峰。如图1(c)所示,化学位移在4.8～5.1和4.02处是聚合物链段P(DEAEMA-r-HFBMA)结构中-CHF-和C-CH2N-的质子峰;化学位移在3.66处是聚合物链段mPEG结构中骨架-CH2CH2O-的质子峰;其他化学位移质子峰的归属均在图1(c)中标出。

图1 (a)无规共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的合成路线;无规共聚物(b)FT-IR谱图和(c)1H NMR谱图

无规共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的分子量及分子量分布信息详细罗列在表1中。无规共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的Mn大小为10 600 g/mol;Mw/Mn的大小为1.20,说明无规共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的分子量分布均一。

表1 无规共聚物GPC分子量信息

2.2 mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)在水中自组装后的形貌及分散性表征

通过TEM对共聚物自组装后的形貌和粒径大小进行了表征,无规共聚物自组装形成粒径大小均匀的囊泡结构,囊泡的粒径大小为(220±10) nm,如图2(a)所示。图2(b)是自组装后分散在缓冲溶液中的DLS结果,在缓冲溶液中分散的囊泡结构水力直径Dh,DLS=(231±8) nm,多分散性指数PDI=0.12,说明自组装形成的囊泡结构分散性良好。TEM和DLS粒径结果差异是因为测试条件的不同引起的,TEM测试时囊泡结构处于干燥状态,而DLS测试时囊泡结构分散在水溶液中,导致DLS所测得的粒径略微比TEM测得的粒径偏大。同时,通过zeta电位测试对囊泡结构表面的带电性和胶体稳定性进行了表征,囊泡溶液的zeta电位值为(32.6±0.8)mV,说明囊泡结构在溶液中胶体稳定性良好,能够稳定分散。