模拟肿瘤免疫微环境类器官模型的建立及应用研究进展

冯忘忧，李 佳，廖文静，陈 琳，赵旻烨，杨 红(空军军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710032)

肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)指肿瘤中的肿瘤细胞和多种非肿瘤宿主成分，可促进癌变、肿瘤的发生发展和转移。TME包括间充质来源的细胞(周细胞和成纤维细胞)、驻留或浸润的血管结构(内皮)和免疫细胞网络(天然免疫细胞和获得性免疫细胞)。肿瘤免疫微环境受细胞和体液成分之间的平衡以及各种炎症反应的调节，以支持晚期肿瘤的生长[1-3]。炎症和免疫缺陷状态下癌症的易感性说明了免疫在肿瘤发生过程中的关键作用[4-5]。细胞免疫疗法和药物免疫疗法通过增强机体的免疫监视功能和/或局部调节肿瘤免疫微环境发挥抗癌效果。这些免疫疗法包括针对肿瘤的单克隆抗体、疫苗、模式识别受体靶向疗法和其他非特异性小分子(白细胞介素、干扰素和结肠刺激因子)，且已在临床中应用[6-7]。免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)[8]及过继T细胞疗法(adoptive T cell transfer therapy，ACT)[9]给癌症治疗带来了新的思路。几十年来，癌症研究一直采用体外2D细胞培养、体内异种移植或基因工程动物模型。然而，传统的体外和体内模型都不能很好地模拟人类肿瘤复杂的免疫生物学[10-11]。2D培养与3D培养相比，对肿瘤的癌基因和免疫生物学的模拟不够准确[10-12]。类器官这一平台的兴起为肿瘤免疫生物学的研究提供了一种新的途径。

类器官是指利用成体干细胞、分化细胞，以及正常或肿瘤组织进行体外3D培养而形成的具有一定空间结构的器官类似物[13-15]，目前该技术已迅速应用于癌症模型[16]。一方面，它可以将突变引入野生型组织或诱导的多能干细胞来源的类器官的癌基因或抑癌基因中[17-18]；另一方面，现在可以利用该技术在体外培养人类肿瘤组织来源的类器官(patient-derived organoid，PDO)。3D PDO培养的大规模应用为研究体外肿瘤生物学提供了有效的方法，大型肿瘤生物库的建立能够捕捉到人类癌症的组织学和遗传学特征[19-21]。本文综述了不同的模拟肿瘤免疫的类器官培养策略及其相关的应用研究。

1 模拟肿瘤免疫微环境的类器官系统的培养方法

1.1 浸泡基质胶培养法

浸泡基质胶培养是一种常用的培养方法，在组织培养基下面的3D基质扁平凝胶中培养分离肿瘤细胞。在此过程中，根据组织类型补充各种生长因子和/或通路抑制剂[18，22]。特定的肿瘤组织需要特定的培养条件，但有些细胞因子，如WNT3a、R-spondin、表皮生长因子和骨形态发生抑制剂Noggin通常是大多数组织所需要的，可使干细胞进行自我更新和分化(例如在肠道器官中)[13]。类器官制备过程中组织的解离导致Rho激酶(Rho-associated protein kinase，ROCK)依赖性程序性细胞死亡途径的激活，因此向培养基中添加ROCK抑制剂可以有效提高类器官培养的成功率[23]。这些额外补充的营养因子已被用于气液界面(air-liquid interface，ALI)培养法[24]。浸泡基质胶培养得到的PDO不仅复制了原始肿瘤的遗传和表型多样性，而且潜在地模拟了患者对临床治疗的功能性反应，从而简化了癌症疾病建模和药物筛选的过程[19-20，25]。值得注意的是，典型的浸泡基质胶培养的PDO仅能保留肿瘤细胞，不能保留间质成分[13]。FORSYTHE等[26]通过将肿瘤细胞与来自外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)、脾脏和淋巴结中与患者匹配的免疫细胞共培养，从而产生具有免疫活性的类器官，可用于预测个性化免疫治疗效果的临床前研究。因此，在这个培养系统中的TME建模需要添加外源的免疫细胞共培养，如下所述。

1.2 微流控3D细胞共培养法

3D微流控培养装置里的胶原凝胶可用于培养小鼠或患者来源的肿瘤类器官[17]。肿瘤球体可以在装置中心区域的3D凝胶中生长，其中来自介质通道的介质平行于中心区域，并位于中心区域的两侧。具有同种免疫活性的小鼠模型和患者肿瘤标本衍生的器官型肿瘤球体(murine- and patient-derived organotypic tumor spheroids，MDOTS/PDOTS)，如黑色素瘤和Merkel细胞癌类器官可以持续培养，并评估其生长状态1～2周[27-28]。用流式细胞仪分析其免疫细胞组成，结果显示MDOTS和PDOTS保留了自体淋巴细胞(B细胞和T细胞)、髓系细胞(单核细胞、树突状细胞、髓源性抑制细胞和肿瘤相关巨噬细胞)以及肿瘤细胞[27]。

1.3 ALI培养法

ALI培养法是从原发组织碎片中得到肿瘤细胞及组织中相应的免疫成分，然后将这些成分接种到胶原凝胶中，胶原凝胶处于内部的跨孔培养皿中，而外部培养皿中的培养基可通过穿透性细胞培养小室进入内部以提供养分，胶原凝胶层的顶部通过ALI暴露在空气中，允许细胞获得足够的氧气供应[15，29]。ALI保留了天然组织结构中的含有多种细胞的组织碎片，并可使其生长，例如癌细胞可与内源性基质细胞和免疫细胞在没有重组的情况下整体生长[30]。这种培养方法建立的PDO，癌细胞可与内源性天然基质和免疫成分一起形成，而不需要重建，这与浸泡基质胶培养法不同。保存组织结构的ALI方法也称为外植体培养方法[31]。最初，使用来自不同部位的正常组织(包括小肠、结肠、胃和胰腺)建立的ALI类器官就包含了上皮和间质成分[15，32]。随后，ALI类器官方法被用于培养来自人类活检组织，如黑色素瘤、肾细胞癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，以及具有同种免疫活性的小鼠肿瘤组织类器官[24]。ALI PDO不仅保留了原始肿瘤的基因改变，而且保留了TME复杂的细胞组成和结构，肿瘤实质和间质都被保留，包括成纤维细胞和各种内源性浸润性免疫细胞群[24]。

2 类器官在肿瘤免疫治疗研究中的应用

2.1 模拟免疫检查点抑制剂的反应

虽然上皮细胞来源的PDO广泛存在，但由于它们缺乏免疫成分，会影响免疫治疗评估，例如对ICIs的反应。含有免疫微环境成分的类器官模型为此提供了一种解决办法，在添加外源性免疫成分的浸没基质培养法构建的上皮细胞类器官上已用于模拟免疫检查点治疗反应[33-34]。在分别扩增患者来源的肿瘤类器官和肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)后进行共培养，使TILs能够通过基质胶向PDO迁移，从而对肿瘤细胞产生细胞毒性，这提示可以使用这种共培养系统来评估TILs的功能[33]。用针对大肠癌(colorectal cancer，CRC)中MICA/B和NKG2A抗原的免疫调节抗体处理自体TILs，然后与患者来源的肿瘤球体进行共培养以评估药物有效性，表明了共培养系统在免疫治疗药物筛选中具有潜在价值[34]。微流控和ALI的整体培养系统可以用来对ICI进行功能性建模。在3D微流控培养中，由小鼠和人类肿瘤产生的MDOTS/PDOTS可以通过肿瘤活/死细胞染色评估TILs对肿瘤细胞的杀伤活性，以重现在短期培养过程中对PD-1阻断治疗的敏感性或耐药性，例如，对程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1，PD-1)敏感的MC38和GL261肿瘤，对PD-1中度敏感的CT26肿瘤，对PD-1耐药的B16F10、人黑色素瘤和Merkel细胞癌[27]。在ALI培养中，将来源于小鼠肿瘤的ALI类器官(B16-SIY、MC38和A20)接种到具有同种免疫活性的小鼠身上，经过PD-1或细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)抗体处理后表现出CD8+T激活和肿瘤杀伤，同时伴有抗原特异性的CD8+T细胞增殖，其中T细胞功能是通过流式细胞仪的免疫表型检测和肿瘤细胞活/死染色进行评估[35]。

2.2 扩大免疫疗法的治疗范围

许多为患者带去希望的免疫治疗已经产生了内在和获得性的耐药性[36]。此外，免疫检查点抑制在某些肿瘤组织中的疗效甚微。类器官可以在体外优化现有免疫疗法的疗效；还可以对新的治疗方法进行功能上的评估。临床免疫治疗试验越来越多地探索组合疗法，利用多个免疫检查点(例如PD-1、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4、淋巴细胞活化基因-3、T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域分子3和T细胞活化V结构域Ig)[37]的组合及联合小分子抑制剂治疗癌症。在ICI的基础上可以增加分子靶向治疗，就像使用丝裂原活化蛋白激酶或编码RAF家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂治疗黑色素瘤一样[38]。基于微流体的类器官芯片由聚二甲基硅氧烷和玻璃组成，是在体外环境中模拟药物治疗反应的下一代平台，包含许多微通道和隔室，可进行微小和精确的流体和生化调节[39]，以更好地重现TME中细胞、血管区域和生物力的空间位置。此外，还可精准控制趋化因子和氧气速率等免疫肿瘤学研究的重要因素。在肿瘤免疫微环境中，基于类器官的芯片已用于模拟PD-1/PD-L1抗体在少数恶性肿瘤中的治疗反应。在短期的3D微流体培养中，转移性黑素瘤患者衍生的异种移植物和PDO与自体髓系和淋巴系群体结合的细胞因子图谱显示，当与TANK结合激酶1或kappa B 抑制因子激酶(inhibitor of kappa B kinase，IKK)的抑制剂联合治疗时，对PD-1抗体的反应增强[40]。有研究者利用患者衍生的“胶质母细胞瘤”类器官模型芯片，以评估PD-L1和集落刺激因子1受体抑制后对不同分子亚型的胶质母细胞瘤的作用[41]，通过该平台发现，与前神经胶质瘤相比，影响间充质生态位的胶质母细胞瘤内CD163+M2型肿瘤相关巨噬细胞显著增多，且具有更高的PD-1/PD-L1表达水平，并对ICI治疗的反应更好。上述研究表明联合其他潜在靶点可以探索新的免疫治疗方法，为解决耐药及不敏感问题提供了一种新思路。此外，类器官培养系统正被进一步用于探索与ICI反应和耐药性相关的新机制、治疗组合方式和可能的生物标志物。例如，对MDOTS的细胞因子分析发现，在对PD1阻断部分敏感的小鼠CT26肿瘤中，趋化因子配体2浓度特别高[27]。阻断TBK1/IKKε激酶等固有免疫信号可抑制CT26肿瘤细胞产生的免疫抑制细胞因子，并联合PD-1抑制剂可增强抗肿瘤的细胞毒性[27]。人类癌症(如黑色素瘤、甲状腺癌和Merkel细胞癌)的PDOTS对抗PD1治疗反应的细胞因子图谱证实，在PD-1抗体治疗后，可急性产生趋化因子配体19[chemokine (C-C motif)ligand 19，CCL19]和CXV趋化因子配体13[chemokine (C-X-C motif)ligand 13，CXCL13]等趋化因子；而与黑色素瘤类器官配对的临床样本经过PD-1抗体治疗后同样诱导生成了CCL19/CXCL13[27]。这类研究突出了类器官在体外进行免疫治疗药物研究的潜力，并可扩展到浸泡类器官培养的免疫重建或整体ALI类器官。

2.3 PDO在过继细胞免疫治疗中的应用

ACT免疫疗法是ICI的一种可行的替代疗法，该方法利用基因工程获得T细胞和嵌合抗原受体或识别肿瘤丰富抗原的高亲和力T细胞受体，或者大量的自体TILs，这些抗肿瘤淋巴细胞经过体外扩增，然后回输给患者[42-43]。类器官越来越多地应用于ACT研究，例如开发嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。PDO现在已经被用来模拟针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体靶点的CAR-NK92对CRC类器官的肿瘤抗原特异性细胞毒反应[44]。这种类器官与免疫细胞共培养系统可以用来评估CAR介导的肿瘤特异性细胞毒性[44]。只有上皮细胞的浸泡基质类器官，虽然缺乏免疫成分，但可以作为抗原来源，筛选具有肿瘤反应性的淋巴细胞。例如，在添加白细胞介素2、抗CD28和抗PD-1的培养基中，CRC或NSCLC PDO与自体PBMC共培养产生的肿瘤反应性CD8+T细胞，仅具有主要组织相容性复合体依赖的对自体肿瘤有细胞毒杀伤作用的淋巴细胞可以扩增，但不能扩增正常细胞[45]。包含免疫成分的类器官系统，如微流控或ALI方法，可能同样适用于ACT研究，但有必要进行深入的研究。

2.4 PDO在精准医学与预测免疫治疗反应中的应用

传统基质胶培养的PDO代表了一个很有前途的平台，可用于评估癌症患者对化疗药物和联合放化疗[25]的功能反应。应用PDO来预测患者对常规治疗方式的个体化反应是一个研究热点。由于识别可以预测免疫治疗反应的生物标志物存在困难，所以选择合适的患者群体以提高临床上ICIs的反应率仍然具有挑战性。而整体类器官培养系统由于含有TME，可能具有潜在的特殊作用。在含有肿瘤细胞和自体免疫成分的PDOTS微流控培养中，对T细胞杀伤肿瘤细胞的能力进行为期1周的评估以及细胞因子分析，结果表明该模型能够预测或评估患者对ICI治疗的反应[27]。ALI类器官也可以通过流式细胞仪、荧光染色和肿瘤杀伤等实验来评估T细胞功能，从而模拟对免疫检查点抑制的反应。这些预测性方法与临床结果的相关性还需要验证，但通过此平台确定对免疫疗法有最佳反应的队列，为临床的转化提供了实质性的机会。

2.5 类器官的研究和产业化现状

类器官这项新兴的技术已经应用到了多个行业多项领域，在基础研究方面涉及到多个学科，如发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、精准医学以及药物毒性和疗效测试。此外，类器官在再生医学领域中可以用于替换患者受损的组织，为自体或异体细胞治疗提供了可能性。类器官技术在临床诊疗中的应用，主要是指导临床用药和精准治疗[46]。事实上，类器官技术已被纳入临床试验中，国内2017年起注册且获伦理委员会批准的类器官临床试验研究有20项，涵盖8个癌种，包括消化系统肿瘤、胰腺肿瘤和乳腺肿瘤等。随着类器官应用范围的扩大及技术的发展趋于成熟，市场上也出现了较为完善的类器官产业链，由医院和科研人员提供样本，公司可以提供耗材试剂、类器官培养、类器官验证及类器官产品等服务。类器官的需求方主要分为科研应用、临床应用和研发应用。类器官的科研应用目前主要集中在疾病模型研究、疗效预测等方向。而类器官服务方以销售试剂耗材为主，对高度定制化需求难以提供标准化服务。临床研究应用目前主要为癌症中晚期患者提供精准治疗[47]，且以化疗药的敏感性检测为主。类器官在商业市场的应用主要在新药研发以及拓展适应证等方向，但仍处在初始阶段。上述产业涉及到的主要为普通类器官技术，由于模拟肿瘤和免疫微环境相互作用关系的技术难度较大，且考虑到周期、成本等关键应用因素，免疫型类器官相关产业发展较为滞后，但未来类器官用于免疫治疗的检测具有很大的潜力。

3 结束语

综上所述，无论是从原代野生型组织还是直接从肿瘤活检组织中培养出来的人类恶性肿瘤类器官，正在迅速改变着体外癌症实验和临床转化的形式。类器官应用于肿瘤免疫学研究的内在需要是将免疫成分与肿瘤细胞结合起来，而重组和整体培养方法都可以实现。最理想的是，类器官内的TME包含完全不同的免疫细胞，包括T、B、NK、髓系细胞和其他天然免疫细胞，并且可能包含TILs和外周的免疫细胞群。将肿瘤类器官与PBMC或淋巴结中的外周免疫细胞共培养，也可以对肿瘤免疫循环进行建模，包括T细胞的启动/激活、T细胞向肿瘤的迁移/渗透以及T细胞对肿瘤细胞的识别/杀伤。将病原体或共生微生物群引入具有免疫细胞的肿瘤类器官中，可以通过病原体、上皮细胞和免疫细胞的相互作用，重现癌症相关的炎症和癌变过程，从而能够评估免疫调节结果和免疫治疗反应。这些均体现类器官在肿瘤免疫应用中强大的潜能[48]。

免疫类器官研究的重要挑战包括模拟免疫疗法的敏感性和耐药性、跨越检查点抑制、开发新的途径和ACT策略。除了阐明潜在的耐药途径外，类器官还可能提升治疗效果，如体外筛选和优化药物和细胞免疫疗法；如培养过程中的短期反应确实能够准确反映临床反应和长期结果，还可以允许实时确定患者对单一或联合治疗的敏感性。尽管类器官被誉为“近似器官”，并在基础癌症研究和临床应用中显示出巨大潜力，但目前一些具有挑战性的瓶颈和困难仍有待解决：①类器官的建立、维护和传代成本高昂。应为不同的肿瘤细胞建立优化和标准化的培养条件，以大规模提高肿瘤细胞的再现性，并促进类器官技术在高通量药物筛选中的应用。②培养类器官所用的组织样本只是整个肿瘤的一小部分。肿瘤的高度异质性对用小块代替整个肿瘤组织的可靠性提出了质疑。从同一肿瘤的不同部位提取组织可更好地反映肿瘤异质性，并促进癌症转化研究。③目前的类器官技术无法轻易复制患者特定免疫环境的复杂性。尽管肿瘤和免疫细胞的共培养系统促进了肿瘤-免疫相互作用模型的建立，但仍存在一些阻碍对免疫疗法反应准确建模和预测的问题。例如，不同的肿瘤类型具有不同的免疫成分和不同的细胞数量，这会影响类器官早期培养过程中免疫细胞的组成以及后期维持和扩增这些免疫细胞。一些肿瘤含有多种复杂类型的免疫细胞，而其他肿瘤类型仅在周围基质中具有免疫细胞或缺乏免疫细胞[49]。此外，尽管在培养初期免疫细胞可以持续存在，但随着时间的推移，可能会丢失和减少[50]。肿瘤免疫环境的不精确建模阻碍了类器官在转化医学和精准医学中的应用。类器官已成为研究热点，许多实验室已开展相关实验，市面上也出现了提供类器官技术服务的产业，包括提供类器官耗材、类器官验证服务以及类器官芯片产品等，且由于普通类器官技术成熟，其产业链也相对较为完善，但免疫类型的类器官由于以上限制，该技术未能在临床得到广泛应用，其相关产业也处于初步发展阶段。当前和未来的类器官方法学将大大促进免疫肿瘤学基础科学和临床研究的发展，人们期待能利用这一手段为患者带来良好的治疗效益，开辟一条实现人类肿瘤免疫治疗的希望之路。