中医药治疗鼻咽癌用药规律分析与网络药理学研究

龙远雄，韩蜜，2，朱镇华，陈镇，邓桂明（.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 40007；2.湖南省肿瘤医院，湖南 长沙 4003）

鼻咽癌是一种鳞状上皮细胞癌，与其他肿瘤相比，具有明显的地理分布特征，据统计全球约一半病例来自中国，其中以岭南地区居多[1-2]。目前鼻咽癌的病因尚未完全明确，现代医学认为其发生是多因素、多基因以及多步骤综合作用的结果，与EB病毒感染、遗传、环境因素密切相关。放疗是治疗鼻咽癌行之有效的方法，但放疗存在敏感性低、毒副作用大（如口腔黏膜损伤、腹胀腹痛）等弊端，被患者排斥[3]。中医药与放疗等西医相结合治疗鼻咽癌具有减毒增效作用。因此，本研究对中国知网（CNKI）、万方数据库（Wanfang）、维普中文科技期刊（VIP）等数据库中有关中医药治疗鼻咽癌的临床研究文献进行挖掘，总结用药规律，聚类形成新方，基于网络药理学探讨新方可能的作用机制，以期为鼻咽癌的治疗与新药研发等提供新思路。

1 资料与方法

1.1 数据来源与检索策略以中国知网、万方数据源、维普中文科技期刊为数据来源。中国知网：选择高级检索，检索格式：（主题=经验）OR（主题=验方）OR（主题=医案）AND（主题=鼻咽癌）；万方数据库：选择专业检索，检索格式：主题：（“经验”OR“验方”OR“医案”）AND 主题：（鼻咽癌）；维普数据库：选择高级检索，选择题名或关键词，检索式：“医案”OR“验方”OR“经验”AND“鼻咽癌”。文献发表时间从建库至2023年2月15日。

1.2 纳入标准①中医药治疗鼻咽癌的临床随机对照试验或者临床观察，观察对象符合《肿瘤中医诊疗指南（ZYYXH/T 136-156-2008）》[4]中鼻咽癌的诊断标准等（症见鼻塞、鼻衄、流涕或涕中带血、耳鸣及耳聋，头痛等，CT、MRI、间接鼻咽镜检查、鼻咽纤维镜检查等观察具体部位的异常及结构改变；病理学诊断：结节型、菜花型、黏膜下浸润型和溃疡型肿块等）。②结果报告临床疗效确切；③干预措施为中药内服方剂，涉及的中药处方组方完整。

1.3 排除标准①诊断标准不明确的文献；②单味中药处方；③非临床治疗类文献，如动物实验等；④重复发表的文献仅纳入其中1篇。

1.4 数据预处理将药物名称按照《中国药典》[5]或《中药学》[6]进行标准化，保证一药一名。如“麦门冬”标准化为“麦冬”。

1.5 数据统计分析应用中医传承辅助平台（V2.5）进行数据挖掘，统计高频药物、药对，通过关联规则与熵聚类方法分析形成新方，根据新方功效，结合中华中医药学会《肿瘤中医诊疗指南》[7]中鼻咽癌4个主要证型（热邪犯肺证、肝郁痰凝证、血瘀阻络证和气阴两虚证），选择最具研究意义的新方开展网络药理学研究[7]。

1.6 新方1 有效化合物及作用靶点查询通过TCMSP平台（http://lsp，nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索中药成分，根据口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18 筛选有效化合物，通过其MOL ID 号检索各成分作用靶点，利用Uniprot 数据库（http://www.uniprot.org/）检索靶点基因名。对TCMSP数据库未载入的中药通过Herb数据库（http://www.herb.org/）检索有效成分，通过SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch）数据库预测其有效靶点。

1.7 鼻咽癌靶点的预测在GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库中输入“Nasopharyngeal carcinoma”获取鼻咽癌靶点。并与新方1 靶点取交集，得到治疗鼻咽癌的相关靶点。

1.8 “化合物-靶点”网络构建将交集靶点导入Cytoscape 3.7.1 软件，形成化合物-靶点网络图，并利用“NetworkAnalyzer”进行分析，筛选出作用于鼻咽癌的关键化合物。

1.9 蛋白互作网络构建及核心靶点筛选将交集靶点导入STRING 数据库构建交集靶点蛋白互作（proteinprotein interaction，PPI）网络。借助Cytoscape 3.7.1对网络进行拓扑分析，选取连接度（Degree）、介数（Betweenness）、中心度（Closeness）均大于均值的靶点为核心靶点。

1.10 GO 功能及KEGG 通路富集分析将交集靶点导入DAVID 6.8 数据库（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp），进行GO 功能富集和KEGG 通路分析，并用微生信平台进行可视化处理。

1.11 分子对接将筛选的关键化合物（小分子）与核心靶蛋白进行对接。靶蛋白X射线晶体结构来自PDB蛋白质数据库。化合物小分子结构来源于TCMSP 数据库。使用Autodock Vina 1.2.0 进行分子对接。选取最优结合构象分析相互作用，利用PyMOL 2.2.0生成对接可视化图。若结合能小于-5 kcal·mol-1表示具有较好的结合活性，小于-7 kcal·mol-1表示具有强烈的结合活性[8]。

2 结果

共检索到749篇文献，按纳入和排除标准进行筛选，最终得到102 篇文献，从中提取有效治疗处方115首，涉及中药271味。

2.1 药物频次统计在271味药物中，累计使用频次1 457 次，使用频次排前5 位的中药依次为甘草、麦冬、玄参、生地黄、白花蛇舌草。治疗鼻咽癌高频中药（频次≥10次）共45味。见表1。

表1 治疗鼻咽癌的高频药物统计（频次≥10 次）Table 1 High frequency drug statistics for the treatment of nasopharyngeal carcinoma（frequency≥10）

2.2 中药功效分类统计对271味按中药功效进行分类[6]，可分为18 类。见表2。使用频次排前5 位的依次为补虚药、清热药、解表药、化痰止咳平喘、活血化瘀药，其使用频率合计占比为79.34%。

表2 治疗鼻咽癌的中药功效类别频数统计Table 2 Frequency statistics of traditional Chinese medicine categories for treating nasopharyngeal carcinoma

2.3 关联规则分析将支持度个数设为12，置信度设为0.6，得到常用核心药对25 组（见表3），强关联药物组合14个（见表4），核心药物关联图谱见图1。

图1 治疗鼻咽癌的核心药物关联图谱Figure 1 The association map of core drugs for the treatment of nasopharyngeal carcinoma

表3 治疗鼻咽癌的核心药对统计Table 3 Statistics of core drug pairs for the treatment of nasopharyngeal cancer

表4 治疗鼻咽癌的关联规则分析结果表（置信度≥0.6）Table 4 Analysis results of association rules for the treatment of nasopharyngeal cancer（Confidence level ≥0.6）

2.4 基于熵聚类的核心组合及新方组合分析根据筛选出的治疗鼻咽癌方剂数量、综合临床用药经验进行判断及不同参数提取数据的预读[9]，选择相关度为4，惩罚度为2，进行层次聚类分析，得到治疗鼻咽癌方剂中271味中药两两之间的关联度，其中基于复杂系统熵聚类，演化出3 味药的核心组合共计14 个。在以上核心组合的基础上，进行无监督熵层次聚类，有8 个核心组合参与聚类（见表5），得到4 个新处方（见表6），并利用中医传承辅助平台（V2.5）的网络展示功能进行展示，见图2。

图2 治疗鼻咽癌新处方药物网络展示Figure 2 Network display of new prescriaption drugs for treating nasopharyngeal carcinoma

表5 治疗鼻咽癌新方聚类的核心组合Table 5 Core combinations of new prescription clustering for the treatment of nasopharyngeal carcinoma

表6 基于无监督熵层次聚类治疗鼻咽癌的新处方Table 6 New prescription for nasopharyngeal carcinoma based on unsupervised entropy hierarchical clustering

2.5 新方1 的网络药理学研究

2.5.1新方1 有效化合物及靶点 新方1 中药组成为麦冬、生地黄、玄参、黄芪、女贞子、枸杞子。获得麦冬有效化合物4个，对应靶点156个；生地黄有效化合物23 个，对应靶点304 个；玄参有效化合物9 个，对应靶点36 个；黄芪有效化合物21 个，对应靶点214 个；女贞子有效化合物13 个，对应靶点182 个；枸杞有效化合物15 个，对应靶点64 个。去重后，新方1有效化合物79个，靶点数430个。

2.5.2新方1 治疗鼻咽癌的疾病靶点预测 检索获得鼻咽癌相关靶点数2 161 个。将新方1 获得的430 个靶点，与鼻咽癌2 161个靶点基因比对，获取交集靶点165个，其可能是治疗鼻咽癌的相关靶点，对应的活性化合物60个，可能为新方1治疗鼻咽癌的有效成分。

2.5.3化合物-靶点网络构建与分析结果 利用Cytoscape 3.7.1 软件对60 个活性化合物和165 个靶点构建化合物-鼻咽癌靶点网络（见图3），并利用Network Analyzer 功能对网络进行分析，将连接度（Degree）＞10的化合物视为新方1治疗鼻咽癌的关键化合物，共获得10个化合物。见表7。

图3 新方1 有效化合物-鼻咽癌靶点的网络图Figure 3 Network diagram of effective compounds of New Prescription 1-targets of nasopharyngeal cancer

表7 新方1 治疗鼻咽癌的关键化合物（Degree＞10）Table 7 Key compounds of New Prescription 1 for the treatment of nasopharyngeal cancer（Degree＞10）

2.5.4蛋白互作网络构建与关键靶点筛选 在165 个交集靶点的PPI 网络中，有161 个靶点间存在互作关系（见图4），拓扑分析显示网络中Degree、Betweenness、Closeness 值均大于平均值（分别为44.23、0.566、0.005）的靶点共39 个（见表8），这些靶点可能是新方1的主要作用靶点。

图4 治疗鼻咽癌的交集靶点蛋白互作（PPI）网络图Figure 4 PPI network diagram of intersection target protein for the treatment of nasopharyngeal cancer

表8 新方1 治疗鼻咽癌的关键靶点Table 8 Key targets of New Prescription 1 for the treatment of nasopharyngeal cancer

2.5.5GO 功能与KEGG 通路富集分析结果 GO 功能分析富集得到518 个条目（P＜0.01），包括生物过程（BP）417 个、细胞组成（CC）37 个和分子功能（MF）64 个。KEGG 通路富集得到信号通路141 条（P＜0.01）。选择富集显著性（按P值升序）排前10 位的生物进程、分子功能、细胞组成，以及排前15 位的通路进行展示。结果见图5和图6。

图5 中医药治疗鼻咽癌的GO 功能富集分析Figure 5 GO enrichment analysis results of TCM for the treatment of nasopharyngeal cancer

图6 中医药治疗鼻咽癌的KEGG 富集分析Figure 6 KEGG enrichment analysis results of TCM for the treatment of nasopharyngeal cancer

2.5.6分子对接 将新方1 中Degree 值最高的3 个核心活性成分和前3 个靶点蛋白进行分子对接。见表9。结果显示，活性成分与靶点蛋白的结合能均小于-5 kcal·mol-1，其中配体槲皮素与受体TP53（SER-269）形成氢键，齐墩果酸与TP53（ASP-268）、AKT1（LYS-154）、TNF（LYS-65）形成氢键，结合能均小于-7 kcal·mol-1，表明其结合力较强，对接模型见图7。

图7 核心活性成分与靶点蛋白的对接模型Figure 7 Visualization of the docking between key compounds and core targets

表9 中医药治疗鼻咽癌的核心活性成分与靶点蛋白对接结果Table 9 Molecular docking results of core active ingredients of TCM for the treatment of nasopharyngeal cancer and target proteins

3 讨论

鼻咽癌归属于中医学“矢荣”“岩”“上石疽”等范畴[10]。中医认为其产生多因正气内虚、外感邪毒、内伤七情等致脏腑功能失常，而产生气郁、血瘀、痰浊等病理产物，日久渐积而成，其病机以本虚标实为特点。现代医家对中医药治疗鼻咽癌的理论和临床进行了大量探索，积累了丰富的辨治经验，由于中医治疗各有特色，其用药规律需进一步归纳整理，因此，本研究运用中医辅助传承平台挖掘中医药治疗鼻咽癌的用药规律。

本研究共获得中医药治疗鼻咽癌的有效处方115 首，涉及中药271 味，累计使用频次1 457 次，使用频次排前5 位的中药依次为甘草、麦冬、玄参、生地黄、白花蛇舌草。甘草具有补脾益气，缓急止痛的功效，在处方配伍中能调和诸药，常作为使药。同时，甘草具有抗肿瘤的作用，所含的异甘草素能诱导肿瘤细胞凋亡和自噬，调节相关信号通路以抑制肿瘤细胞生长[11]。麦冬为养阴生津之品。研究[12]发现麦冬可促进唾液分泌，改善放疗后的阴虚症状。玄参滋阴降火，解毒散结，所含玄参多糖能抑制肿瘤细胞活性、增强机体免疫功能[13]。生地黄与玄参同属于清热凉血养阴之品，可用于热毒炽盛鼻咽癌患者的治疗。白花蛇舌草清热解毒，所含多糖对鼻咽癌细胞增殖有显著的抑制作用，且其水提物能提高鼻咽癌患者放疗的临床疗效，具有增敏作用[14]。根据药物功效的不同，治疗鼻咽癌的中药可分为18 类，其中补虚药比例最高，占32.33%，体现治疗鼻咽癌的关键在于扶正补虚，大量运用健脾补中益气中药，包括甘草、黄芪、白术等。清热药次之，占比为26.97%。鼻咽癌初期患者，易出现火毒郁结、毒热内阻，病性为实，可以使用玄参、生地黄、白花蛇舌草等清热药治疗。其后依次为解表药、化痰药、活血化瘀药等。鼻咽癌的高危人群以正虚为主，因正气亏虚，外因六淫之邪可乘虚而入，故以解表药以祛之。当疾病进一步恶化时，会伴有明显的夹热夹瘀、火毒郁结、痰浊结聚、气血瘀阻等症状，此时，应予以活血化瘀、化痰散结之治法，故在鼻咽癌的治疗中补虚药、清热药、解表药、化痰药、活血化瘀药最为常用。

关联分析结果显示，麦冬、玄参、生地黄两两组合使用频率较高，且3味药之间形成的关联规则也具有较高的置信度，如生地黄，玄参→麦冬的置信度最高，说明这3味药组合使用最常见。该组合即为增液汤，凸显清热凉血养阴之功效，常用于鼻咽癌化疗后阴虚证的治疗。药对麦冬-甘草、玄参-甘草、麦冬-太子参，以及关联规则：玄参、甘草→麦冬，太子参→麦冬，体现了益气健脾、养阴生津的治法；石斛-麦冬疏清虚热、补益脾胃；黄芪-甘草健脾补气；麦冬-南沙参养阴清热、益胃生津；黄芪-白术、党参-白术等益气健脾，燥湿利水；连翘→金银花清热解毒。基于无监督熵层次聚类生成了4个新方，其中新方1由麦冬、生地黄、玄参、黄芪、女贞子、枸杞子组成，具有清热凉血、养阴生津、益气健脾利湿、补益肝肾等功效。新方2清热解毒、养阴润燥、生津止渴；新方3健脾化湿、温中和胃；新方4清热解毒、健脾渗湿、补益脾胃、破血行气。综合高频药物、功效归类及药物关联特点，总结推断中医药治疗鼻咽癌以益气养阴、清热解毒为主，兼顾活血化瘀，强调脾胃、肝肾同调，重视健脾益胃、补益肝肾、渗湿利水等治法。

鼻咽癌治法以益气养阴、清热解毒为主，结合新方1所体现的清热益气养阴的功效，故以新方1为例开展网络药理学研究。通过网络药理学分析，获得新方1 治疗鼻咽癌的有效化合物60 个，关键化合物10 个，作用于鼻咽癌靶点165 个，核心靶点39 个，排前3位的关键化合物为槲皮素、齐墩果酸、木樨草素，排前3 位的核心靶点为TP53、AKT1、TNF。槲皮素为黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化等作用，能通过调控抑癌基因的表达，影响肿瘤细胞生命周期[15]；齐墩果酸能抑制肿瘤微循环，预防肿瘤形成，能剂量依赖性抑制鼻咽癌细胞增殖[16]。同时能逆转放化疗耐药性，调节免疫功能等。木樨草素能通过调节信号通路、阻滞细胞周期来抑制肿瘤细胞生长，还可以改变丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等活性抑制癌细胞浸润[17]。TP53 抑瘤基因为各类肿瘤常见核心靶点之一，TP53 在应激条件下激活后，可以启动肿瘤细胞凋亡程序，抑制细胞增殖与肿瘤血管生成，在癌症的发生发展中起至关重要的作用[18]；AKT1 是一种抗凋亡蛋白激酶，能促进肿瘤细胞侵袭、加速肿瘤转移，在其变异情况下可提高鼻咽癌患病风险[19]；TNF对鼻咽癌的作用表现为双重调控机制，既有抗瘤活性，又能作为内源性的肿瘤促进因子，可刺激肿瘤细胞生长、增殖、侵袭与转移[20]。

GO 功能与KEGG 通路富集分析得到新方1 号治疗鼻咽癌有显著性影响的条目518 个、信号通路141 条，涉及到RNA聚合酶II启动子的顺向调控、细胞凋亡的负向调控等生物过程，还涉及到癌症传导、PI3K-AKt 信号传导、AGE-RAGE 信号传导、MAPK 信号传导、EBV 感染等重要信号通路。其中PI3K-Akt 信号通路作为生长因子调控细胞增殖和存活的重要通路，可参与癌细胞增殖、分化、迁移、凋亡等过程，与鼻咽癌的发生及预后有密切联系[8]。研究[21]发现癌细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力与AGE-RAGE、PI3K-Akt 信号通路介导的上皮-间质转化有关。MAPK信号转导通路可将细胞外化学信号传递至细胞内，引起细胞内部一系列生物学反应，参与细胞分化、增殖、凋亡和血管生成等调节。MAPK 通路中的数个蛋白在人类癌症中存在突变、扩增或缺失，促进癌细胞增殖、生存等[22]。EB病毒感染与鼻咽癌密切相关，它可与多条通路相互作用导致肿瘤细胞增殖分化，共同参与抑制免疫、病毒潜伏、整合基因、侵袭转移、抑制凋亡等生物过程[23]。

分子对接实验结果显示，新方1的关键成分与核心靶点形成了多组相互作用力，如齐墩果酸分别与核心靶点TP53、AKT1、TNF 的结合位点ASP-268、LYS-154、LYS-65形成了氢键，在这些相互作用力的作用下，蛋白小分子复合物的结合能小于-7 kcal·mol-1，其结合能较强，表明它们在治疗鼻咽癌方面可能发挥重要作用。

综上，本研究了总结中医药治疗鼻咽癌的用药规律，通过网络药理学研究与分子对接验证探讨了数据挖掘结果形成的新方在鼻咽癌治疗中可能的作用机制。网络药理学研究结果表明新方1可能通过槲皮素、齐墩果酸、木樨草素等关键成分作用于鼻咽癌TP53等核心靶点，影响RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物学过程及癌症通路、PI3K-Akt 通路等，发挥治疗鼻咽癌的作用。本研究可为鼻咽癌的中医药治疗与新药研发提供一定的参考。