黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞增殖的影响及作用机制研究

王刘玉,万全会,陈军

(南阳市第二人民医院,河南 南阳 473003)

骨质疏松症是以骨量丢失、骨微结构破坏为特征的临床常见骨病,骨质疏松症患者骨骼脆性的增加会使骨折风险增加,不仅影响患者的生活质量,也增加了家庭和社会的经济负担。骨质疏松症的发病涉及多因素、多环节、多机制,其中成骨细胞的增殖和分化受到抑制是造成骨量丢失、骨微结构破坏的重要环节[1-2]。因此,调节成骨细胞增殖和分化也被认为是治疗骨质疏松症的重要研究方向。近年来,中药汤剂在骨质疏松症治疗中的价值受到了越来越多的关注。黄芪是具有补气升阳、益卫固表作用的一味中药,是多种具有补骨作用的中药方剂的重要组成药物[3-6]。黄芪多糖是黄芪中的多糖类活性成分,相关研究发现黄芪多糖能够促进间充质干细胞的成骨分化[7],调控成骨细胞中维生素D受体、1α-羟化酶、24-羟化酶的表达[8-9]。为了进一步探讨黄芪多糖对成骨细胞增殖的影响及作用机制,我们以MC-3T3-E1成骨细胞为实验对象进行了相关研究,现总结报告如下。

1 材料与仪器

1.1 实验材料MC-3T3-E1成骨细胞,购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 实验试剂DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Hyclone公司,黄芪多糖、腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制剂Compound C(美国Sigma公司),MTS细胞活力检测试剂盒(美国Promega公司),放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)试剂盒(上海碧云天生物科技公司),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、B淋巴细胞瘤-2(B-lymphoblastoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-related X protein,BAX)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease,Caspase)-3、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)一抗及辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白G二抗(美国Abcam公司),增强型化学发光显影液(美国Thermo公司)。

1.3 实验仪器HERAcell 240型细胞培养箱(美国Thermo公司),Synergy LX型多功能酶标仪(美国BioTek公司),ChemiDoc MP化学显影仪(美国Bio-Rad公司)。

2 方 法

2.1 MC-3T3-E1成骨细胞培养方法用含有10%FBS的DMEM培养基培养MC-3T3-E1成骨细胞,待细胞铺满培养瓶底面90%后,用胰蛋白酶进行消化,按照1∶3的比例进行传代。传代后的细胞继续贴壁培养和消化传代,收集第3代细胞,接种于培养板中进行分组及干预处理。

2.2 分组及干预方法将收集的第3代MC-3T3-E1成骨细胞,分别接种于96孔和12孔培养板,各接种25孔,各分为黄芪多糖低、中、高浓度组及黄芪多糖联合抑制剂干预组、对照组,每组各5孔。黄芪多糖低、中、高浓度组分别用含有0.1 mol·L-1、1.0 mol·L-1、10 mol·L-1黄芪多糖的DMEM培养基进行培养,黄芪多糖联合抑制剂干预组用含有10 mol·L-1黄芪多糖和10 μmol·L-1Compound C的DMEM培养基进行培养,对照组用DMEM培养基进行培养。

2.3 MC-3T3-E1成骨细胞增殖活力检测方法培养24 h后,于96孔培养板内,分别加入20 μL MTS试剂,置于培养箱中继续培养4 h。取出培养板后,充分震荡,在酶标仪上测定各样品于490 nm波长处的吸光值。

2.4 MC-3T3-E1成骨细胞增殖相关基因蛋白表达检测方法培养24 h后,弃去12孔培养板内的培养基,加入RIPA裂解液裂解细胞,离心后提取总蛋白。采用BCA试剂盒测定总蛋白浓度,每个样品取30 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后,将凝胶上的蛋白湿转至硝酸纤维素膜,用5%脱脂牛奶在室温封闭2 h,加入ALP、OCN、Bcl-2、BAX、Caspase-3、p-AMPK、eNOS一抗,于4 ℃孵育过夜;洗膜后,加入辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白G二抗,于室温孵育2 h;加入增强型化学发光显影液。于化学显影仪中显影、拍照,用imageJ软件分析蛋白条带灰度值,以β-肌动蛋白为参考,计算各蛋白的相对表达量。

2.5 数据统计方法采用SPSS20.0统计软件对所得数据进行统计学分析。细胞增殖活力及ALP、OCN、Bcl-2、BAX、Caspase-3、p-AMPK、eNOS蛋白表达量的组间比较均采用单因素方差分析,组间两两比较均采用LSD-t检验;检验水准α=0.05。

3 结 果

3.1 MC-3T3-E1成骨细胞增殖活力检测结果黄芪多糖低、中、高浓度组及黄芪多糖联合抑制剂干预组、对照组细胞增殖活力比较,组间差异有统计学意义(0.59±0.06,0.71±0.08,0.97±0.14,0.60±0.07,0.41±0.06,F=28.832,P=0.000)。黄芪多糖低、中、高浓度组细胞增殖活力及黄芪多糖联合抑制剂干预组均大于对照组(LSD-t=4.743,P=0.002;LSD-t=6.708,P=0.000;LSD-t=8.221,P=0.000;LSD-t=4.608,P=0.002);黄芪多糖低浓度组细胞增殖活力与黄芪多糖联合抑制剂干预组比较,差异无统计学意义(LSD-t=0.243,P=0.811),黄芪多糖中、高浓度组细胞增殖活力均大于黄芪多糖联合抑制剂干预组(LSD-t=2.314,P=0.049;LSD-t=5.286,P=0.001);黄芪多糖低、中浓度组细胞增殖活力均小于黄芪多糖高浓度组(LSD-t=5.579,P=0.001;LSD-t=4.423,P=0.010);黄芪多糖低浓度组细胞增殖活力小于黄芪多糖中浓度组(LSD-t=2.683,P=0.028)。

3.2 MC-3T3-E1成骨细胞成骨标志基因蛋白表达检测结果5组细胞ALP、OCN的蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义。黄芪多糖低、中、高浓度组细胞ALP、OCN的蛋白表达量均高于对照组(ALP:LSD-t=3.528,P=0.008;LSD-t=4.417,P=0.002;LSD-t=6.822,P=0.000;OCN:LSD-t=3.153,P=0.014;LSD-t=6.485,P=0.000;LSD-t=6.543,P=0.000)和黄芪多糖联合抑制剂干预组(ALP:LSD-t=2.414,P=0.042;LSD-t=3.155,P=0.013;LSD-t=5.892,P=0.000;OCN:LSD-t=2.339,P=0.047;LSD-t=5.926,P=0.000;LSD-t=14.546,P=0.000),黄芪多糖联合抑制剂干预组细胞ALP、OCN的蛋白表达量与对照组比较,差异均无统计学意义(LSD-t=1.186,P=0.270;LSD-t=1.145,P=0.285);黄芪多糖低、中浓度组细胞ALP、OCN的蛋白表达量均低于黄芪多糖高浓度组(ALP:LSD-t=3.727,P=0.006;LSD-t=3.702,P=0.006;OCN:LSD-t=4.737,P=0.001;LSD-t=2.625,P=0.031);黄芪多糖低浓度组细胞ALP的蛋白表达量与黄芪多糖中浓度组比较,差异无统计学意义(LSD-t=0.392,P=0.705),黄芪多糖低浓度组细胞OCN的蛋白表达量低于黄芪多糖中浓度组(LSD-t=3.366,P=0.010)。见图1、表1。

表1 5组MC-3T3-E1成骨细胞成骨标志基因蛋白相对表达量

注:ALP为碱性磷酸酶,OCN为骨钙素,β-actin为β-肌动蛋白,①为对照组,②为黄芪多糖低浓度组,③为黄芪多糖中浓度组,④为黄芪多糖高浓度组,⑤为黄芪多糖联合抑制剂干预组。

3.3 MC-3T3-E1成骨细胞线粒体凋亡途径相关基因蛋白表达检测结果5组细胞中Bcl-2、BAX、Caspase-3的蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义。黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖联合抑制剂干预组细胞Bcl-2的蛋白表达量与对照组比较,差异均无统计学意义(LSD-t=1.746,P=0.119;LSD-t=0.859,P=0.415),黄芪多糖中、高浓度组细胞Bcl-2的蛋白表达量均高于对照组(LSD-t=5.238,P=0.001;LSD-t=9.618,P=0.000)和黄芪多糖联合抑制剂干预组(LSD-t=3.821,P=0.006;LSD-t=8.246,P=0.000);黄芪多糖低浓度组细胞Bcl-2的蛋白表达量与黄芪多糖联合抑制剂干预组比较,差异无统计学意义(LSD-t=0.620,P=0.552);黄芪多糖低、中浓度组细胞Bcl-2的蛋白表达量均低于黄芪多糖高浓度组(LSD-t=8.875,P=0.001;LSD-t=6.102,P=0.000);黄芪多糖低浓度组细胞Bcl-2的蛋白表达量低于黄芪多糖中浓度组(LSD-t=3.953,P=0.004)。

黄芪多糖低浓度组细胞BAX的蛋白表达量与对照组比较,差异无统计学意义(LSD-t=1.881,P=0.097),Caspase-3的蛋白表达量低于对照组(LSD-t=2.907,P=0.020);黄芪多糖中、高浓度组细胞BAX、Caspase-3的蛋白表达量均低于对照组(BAX:LSD-t=5.285,P=0.001;LSD-t=7.340,P=0.000;Caspase-3:LSD-t=3.654,P=0.006;LSD-t=6.875,P=0.000)和黄芪多糖联合抑制剂干预组(BAX:LSD-t=3.654,P=0.006;LSD-t=6.875,P=0.000;Caspase-3:LSD-t=2.940,P=0.019;LSD-t=6.314,P=0.000),黄芪多糖联合抑制剂干预组细胞BAX、Caspase-3的蛋白表达量与对照组比较,差异均无统计学意义(LSD-t=1.053,P=0.323;LSD-t=0.714,P=0.496);黄芪多糖低浓度组细胞BAX的蛋白表达量均低于黄芪多糖联合抑制剂干预组(LSD-t=3.253,P=0.012;),Caspase-3的蛋白表达量与黄芪多糖联合抑制剂干预组比较,差异无统计学意义(LSD-t=2.212,P=0.058);黄芪多糖低、中浓度组细胞BAX、Caspase-3的蛋白表达量均高于黄芪多糖高浓度组(BAX:LSD-t=7.442,P=0.001;LSD-t=3.690,P=0.006;Caspase-3:LSD-t=4.496,P=0.002;LSD-t=4.642,P=0.002);黄芪多糖低浓度组细胞BAX的蛋白表达量高于黄芪多糖中浓度组(LSD-t=4.548,P=0.002),黄芪多糖低浓度组细胞Caspase-3的蛋白表达量与黄芪多糖中浓度组比较,差异无统计学意义(LSD-t=1.728,P=0.088)。见图2、表2。

表2 5组MC-3T3-E1成骨细胞线粒体凋亡途径相关基因蛋白相对表达量

注:Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2,BAX为B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白,Caspase-3为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶,β-actin为β-肌动蛋白,①为对照组,②为黄芪多糖低浓度组,③为黄芪多糖中浓度组,④为黄芪多糖高浓度组,⑤为黄芪多糖联合抑制剂干预组。

3.4 MC-3T3-E1成骨细胞AMPK/eNOS信号通路相关基因蛋白表达检测结果5组细胞中p-AMPK、eNOS的蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义。黄芪多糖低、中、高浓度组细胞P-AMPK、eNOS的蛋白表达量均高于对照组(p-AMPK:LSD-t=3.082,P=0.015;LSD-t=4.546,P=0.002;LSD-t=5.064,P=0.001;eNOS:LSD-t=3.395,P=0.009;LSD-t=5.873,P=0.000;LSD-t=7.327,P=0.000)和黄芪多糖联合抑制剂干预组(p-AMPK:LSD-t=5.819,P=0.000;LSD-t=6.731,P=0.000;LSD-t=6.961,P=0.000;eNOS:LSD-t=4.851,P=0.001;LSD-t=7.761,P=0.000;LSD-t=8.200,P=0.000),黄芪多糖联合抑制剂干预组细胞p-AMPK、eNOS的蛋白表达量与对照组比较,差异均无统计学意义(LSD-t=1.893,P=0.095;LSD-t=1.455,P=0.184);黄芪多糖中、高浓度组细胞p-AMPK、eNOS的蛋白表达量均高于黄芪低糖高浓度组(p-AMPK:LSD-t=2.370,P=0.045;LSD-t=3.200,P=0.013;eNOS:LSD-t=2.910,P=0.020;LSD-t=4.985,P=0.001);黄芪多糖中浓度组细胞p-AMPK的蛋白表达量与黄芪多糖高浓度组比较,差异无统计学意义(LSD-t=1.048,P=0.325),黄芪多糖中浓度组细胞eNOS的蛋白表达量低于黄芪多糖高浓度组(LSD-t=2.564,P=0.033)。见图3、表3。

表3 5组MC-3T3-E1成骨细胞磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶/内皮型一氧化氮合酶信号通路相关基因蛋白相对表达量

注:p-AMPK为磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶,eNOS为内皮型一氧化氮合酶,β-actin为β-肌动蛋白,①为对照组,②为黄芪多糖低浓度组,③为黄芪多糖中浓度组,④为黄芪多糖高浓度组,⑤为黄芪多糖联合抑制剂干预组。

4 讨 论

成骨细胞的分化和增殖受到抑制是骨质疏松发生和发展过程中的重要病理环节。成骨细胞参与骨形成过程,其正常的分化与增殖能够保证机体的骨量及骨质量;而成骨细胞的分化和增殖受到抑制,则会导致机体骨量丢失、骨微结构改变,进而逐步发展为骨质疏松症。黄芪是补肾壮骨汤、益肾补骨汤等用于治疗骨质疏松症中药方剂中的君药。黄芪多糖是中药黄芪中的有效成分,具有促进细胞增殖、抑制炎症反应、减少自由基生成等多种生物学作用[10-13]。有研究[7,14-15]发现,黄芪多糖能够促进间充质干细胞的成骨分化。但对于黄芪多糖对成骨细胞增殖的影响尚未明确。我们采用不同浓度的黄芪多糖干预MC-3T3-E1成骨细胞,并检测MC-3T3-E1成骨细胞的增殖活力,结果显示,浓度为10 mol·L-1的黄芪多糖能够显著增强MC-3T3-E1成骨细胞的增殖活力,且MC-3T3-E1成骨细胞中成骨标志基因ALP及OCN的蛋白表达量随黄芪多糖浓度升高而显著增加。

成骨细胞增殖受到抑制与线粒体凋亡途径的过度激活关系密切。线粒体释放细胞色素C进入细胞浆,细胞色素C能够通过一系列的级联反应激活Caspase-3,进而诱发细胞凋亡[16]。BAX和Bcl-2是调控线粒体途径凋亡的重要蛋白,BAX能通过促进线粒体释放细胞色素C,进而诱发细胞凋亡;而Bcl-2则能够拮抗BAX,抑制细胞色素C的释放及线粒体凋亡途径的激活[17-18]。相关研究发现,骨质疏松组织中Bcl-2的蛋白表达量减少,而BAX、Caspase-3的蛋白表达量升高[19-20]。我们研究发现,MC-3T3-E1成骨细胞Bcl-2的蛋白表达量随黄芪多糖浓度升高而显著增加,而BAX和Caspase-3的蛋白表达量随黄芪多糖浓度升高而显著降低。因此,黄芪多糖可能通过抑制成骨细胞中线粒体凋亡途径的激活,进而减少成骨细胞凋亡。

AMPK/eNOS信号通路参与调控细胞的增殖和凋亡[21-22]。多项研究[23-25]发现,黄芪多糖能够通过激活AMPK/eNOS信号通路减轻细胞损伤。我们分析了不同浓度黄芪多糖干预后MC-3T3-E1成骨细胞AMPK/eNOS信号通路相关基因的蛋白表达,结果显示随黄芪多糖浓度增加,MC-3T3-E1成骨细胞p-AMPK和eNOS的蛋白表达量显著增加,提示黄芪多糖能够促进成骨细胞中AMPK/eNOS信号通路的激活。为了进一步验证AMPK/eNOS信号通路与黄芪多糖促进细胞增殖的关系,我们采用AMPK抑制剂Compound C联合10 mol·L-1的黄芪多糖干预MC-3T3-E1成骨细胞,结果显示,黄芪多糖联合抑制剂干预组细胞中p-AMPK、eNOS的蛋白表达量低于黄芪多糖高浓度组,而细胞增殖活力小于黄芪多糖高浓度组,ALP、OCN、Bcl-2的蛋白表达量均低于黄芪多糖高浓度组,BAX、Caspase-3的蛋白表达量均高于黄芪多糖高浓度组。因此,我们认为黄芪多糖对成骨细胞增殖的调控作用依赖于AMPK/eNOS信号通路的激活。

本研究结果表明,黄芪多糖能够促进MC-3T3-E1成骨细胞增殖,且该作用具有一定的浓度依赖性,其作用机制可能与调控线粒体凋亡途径及AMPK/eNOS信号通路有关。