一测多评法同时测定结石通片中7 种成分含量

聂 溶，蔡林雪，孟倩颖

（中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院，福建 福州 350000）

结石通片由广金钱草、石韦、玉米须、车前草、茯苓、鸡骨草、白茅根、海金沙草8 味药材组方，具有清热利湿、通淋排石、镇痛止血功效，临床用于治疗泌尿系统感染、尿路结石、血尿、肾炎水肿等病症［1］。其现行质量标准中仅有广金钱草的薄层色谱鉴别项及片剂通则检查项，且文献报道仅对有效成分绿原酸进行了定量控制［2］，难以全面评价该制剂的质量。一测多评（QAMS）法能通过建立相对易得且稳定成分与其他组分之间的相对较正因子（RCF），同步实现多指标含量测定［3-4］。2020 年版《中国药典（一部）》收录了咳特灵胶囊、银杏叶滴丸等中成药含量测定的QAMS 法［5］，亦有研究采用QAMS 法评价中药制剂质量［6-8］。本研究中采用QAMS 法同时测定结石通片中7 种成分的含量，以期为提升该制剂的质量提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司，配有2689 型VWD 紫外检测器）；XP505 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为0.01mg）；KQ -500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

结石通片（陕西康惠制药股份有限公司，批号分别为20211019，20211126，20211222，220314，220507，220620）；夏佛塔苷对照品（批号为111912-202204，含量94.9%），绿原酸对照品（批号为110753-202119，含量96.3%），芒果苷对照品（批号为111528-202210，含量96.6%），大车前苷对照品（批号为11557 - 202003，含量98.9%），均购自中国食品药品检定研究院；异夏佛塔苷对照品（批号为TT20022384，含量92.8%），异牡荆苷对照品（批号为TT2108367，含量97.6%），茯苓酸对照品（批号为TT2205121，含量99.1%），均购自上海同田生物技术有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters SunFire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）- 0.15%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min 时12%A →26%A，20～30 min 时26%A →35%A，30～38 min 时35%A，38～44 min 时35%A →40%A，44～55 min 时40%A →85%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：330 nm（0～44 min时，夏佛塔苷、异夏佛塔苷、异牡荆苷、绿原酸、芒果苷、大车前苷），210 nm（44～55 min时，茯苓酸）；柱温：35 ℃；进样量：10µL［9-11］。

2.2 溶液制备

取各对照品适量，精密称定，加甲醇，制成夏佛塔苷、异夏佛塔苷、异牡荆苷、绿原酸、芒果苷、大车前苷、茯苓酸质量浓度分别为0.386 1，0.131 4，0.292 4，0.512 8，0.403 7，0.228 5，0.230 9 mg/mL 的混合对照品贮备液；精密量取样品2 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，即得混合对照品溶液，室温避光贮藏。取样品10片，除去包衣，研匀，取1.0 g，精密称定，置100 mL棕色容量瓶中，加75%甲醇85 mL，超声（功率450 W、频率40 kHz，下同）处理45 min，放冷，加75%甲醇定容，摇匀，经0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液，室温避光贮藏。按结石通片处方及工艺，分别制备缺广金钱草、石韦、玉米须、车前草、茯苓的单一阴性样品，按供试品溶液制备方法制备各阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性及专属性试验：取2.2 项下3 种溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图（见图1）。结果理论板数按各成分色谱峰计均大于3 500，分离度均大于1.5；阴性对照均无干扰，表明专属性良好。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密量取2.2项下混合对照品贮备液0.2，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别加甲醇制成系列混合对照品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以待测成分质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 方法学考察结果Tab.1 Results of methodological investigation

检测限与定量限考察：取2.2 项下对照品溶液适量，用甲醇逐级稀释，按2.1项下色谱条件进样测定，以信噪比（S/N）约为3∶1、10∶1时待测成分的质量浓度为检测限和定量限。结果见表1。

精密度试验：取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。取同一批供试品溶液（批号为220314）适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，连续3 d，每日进样3 次。结果的RSD均小于2.0%（n=6），详见表1，表明仪器日内精密度良好，方法日间精密度良好。

稳定性试验；取同一批（批号为220314）供试品溶液适量，分别于室温下放置0，4，8，15，20，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD均小于2.0%（n=6），详见表1。表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验；取同一批（批号为220314）样品适量，按2.2项下方法平行制备供试品溶液6份，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果的RSD均小于2.0%（n=6），详见表1。表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为220314）0.5 g，平行6 份，精密称定，置棕色容量瓶中，加入混合对照品溶液适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

2.4 RCF 测定

取线性关系考察项下系列混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图及峰面积。以绿原酸为内参物，按公式RCFk/s=（Ck×As）/（Cs×Ak）计算（其中，C 为质量浓度，A 为峰面积，k 指其他6 种待测成分之一，s指内参物）。结果见表2。

表2 6种成分的相对校正因子（n=6）Tab.2 RCFs of six components（n=6）

2.5 RCF 耐用性考察

色谱仪和色谱柱：取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件，采用2 种高效液相色谱仪（Waters e2695型和Agilent 1260型）和3种色谱柱（Thermo Scientific Acclaim 160 C18柱、Waters SunFire C18柱及Agilent ZORBAX SB C18柱，规格均为250 mm×4.6 mm，5µm）分别进样测定，记录峰面积，并计算RCF。结果夏佛塔苷、异夏佛塔苷、异牡荆苷、芒果苷、大车前苷和茯苓酸的平均RCF 分别为1.333，1.673，1.948，1.953，1.257，1.350，RSD分别为1.74%，1.07%，1.16%，1.05%，1.36%，1.58%。表明色谱仪、色谱柱发生一定变化时本方法能满足试验要求，耐用性良好。

柱温：取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件，采用不同柱温（25，30，35 ℃）进样测定，记录峰面积并计算RCF。结果夏佛塔苷、异夏佛塔苷、异牡荆苷、芒果苷、大车前苷和茯苓酸的平均RCF 分别为1.325，1.667，1.964，1.938，1.253，1.341，RSD分别为1.14%，0.94%，1.12%，0.88%，1.54%，1.09%（n= 3），表明柱温发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，耐用性良好。

2.6 QAMS 法与外标（ESM）法测定结果比较

取6 批样品各适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，平行3 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录夏佛塔苷、异夏佛塔苷、异牡荆苷、绿原酸、芒果苷、大车前苷、茯苓酸的峰面积，分别采用ESM 法和QAMS 法计算各成分含量，组间比较行t检验。结果表明，2 种测定方法的结果无显著差异（P>0.05）。详见表3。

表3 样品中7种成分一测多评法和外标法含量测定结果比较（mg/g，n=3）Tab.3 Comparison of content determination of seven components in samples by QAMS and ESM（mg/g，n=3）

3 讨论

结石通片中广金钱草清热利尿、通淋利湿，为君药；石韦利尿通淋、凉血止血，车前草清热利尿、通淋止痛，茯苓淡渗利湿、通利膀胱，共为臣药；玉米须利尿通淋，为佐药；鸡骨草、白茅根、海金沙草清热利尿解毒，共为使药。研究表明，广金钱草中药效成分主要为夏佛塔苷、异夏佛塔苷黄酮类化合物和绿原酸酚酸类化合物［12］；石韦中芒果苷属双苯吡酮类化合物，具有利尿护肾、抗炎等作用［13］；车前草中大车前苷属苯乙醇苷类化合物［14-15］，具有抗氧化、抗菌、免疫调节等药理作用，是2020 年版《中国药典（一部）》中评价车前草质量的代表性成分；茯苓主要药效成分为三萜类和多糖类，三萜类中茯苓酸含量较高，具有利尿、促进神经伸展等作用［16］；玉米须中主要药效成分为黄酮类成分异牡荆苷［17］。因所需对照品品种多、价格昂贵，且不易获得，在日常检验中较难同时测定7种成分含量，故采用QAMS 法，以绿原酸为内参物，测定其余6 种成分的RCF，并计算含量，从而实现结石通片的多指标质量评价。

QAMS法和ESM法的测定结果差异不明显，提示本研究中所建立的方法结果准确，可用于结石通片的多种有效成分的含量测定。但目标成分含量存在一定的批间差异，如芒果苷含量为0.611～0.700 mg/ g，异夏佛塔苷含量为0.200～0.257 mg/g，可能与制剂的原药材产地、采收、加工等有关，故建立多指标成分评价模式有助于确保结石通片质量的稳定。

综上所述，本研究中建立了同时测定结石通片中7 种成分含量的QAMS 法，且操作简便、结果准确，可用于结石通片多指标成分的质量控制，继而为全面评价该制剂质量提供参考。