基于Fas/FasL信号通路探究调控miR-214-3p对帕金森病大鼠的干预效果

杜姝 傅增辉 姜岩 刘晶 林再红 陈团团

(齐齐哈尔医学院附属第三医院神经内四科,黑龙江 齐齐哈尔 161000)

帕金森病(PD)属于慢性神经系统退行性疾病。多发于中老年,主要临床特征包括肌强直、静止性震颤、姿势反射障碍和运动迟缓〔1,2〕。miRNA在多种细胞活动中有着重要地位,可以指导形成miRNA-mRNA诱导沉默复合体。近几年,在PD中miRNA的作用引起重视,miR-214与各种神经系统疾病密切相关〔3,4〕。目前的研究发现,miR-214作为一种功能性的miRNA,可以抑制海马神经元的自噬和凋亡,故而miR-214-3p的表达可能与PD具有一定的关系〔5〕。研究显示,Fas配体(FasL)属于肿瘤坏死因子(TNF)家族一种细胞表面分子,与其受体Fas结合,从而诱导Fas携带细胞凋亡〔6〕。目前miR-214-3p在PD中的相关研究较少,本研究采用miR-214-3p对PD模型大鼠进行干预,探究其临床指标及与Fas/FasL通路的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取36只清洁级SD雄性大鼠,8～12周龄;平均(9.50±1.90)周龄;体质量180～230 g,平均(194.75±23.75)g,购自河南省动物实验中心,许可证号:SYXK(豫)2017-0002,大鼠均进行常规饲养,自由饮食、饮水,昼夜交替12 h,湿度在50%左右,统一适应性喂养1 w。

1.2PD模型大鼠制备〔7〕采取颈背部皮下注射鱼藤酮制备PD大鼠模型。28只大鼠称体质量后逐日给予鱼藤酮2 mg/kg颈背部皮下注射,将大鼠行为变化分为6个等级计分。1分为大鼠拒逮捕能力减弱,外表颜色变黄变脏,毛发垂直,弓背,主动活动能力减少;2分为在1分大鼠基础上出现主动活动能力明显下降,动作迟缓、震颤、步态不稳;4分为基于2分大鼠行为,步态不稳定、不能直行、行走时向一侧旋转;6分为单侧斜倚,单侧肢体瘫痪,进食困难;8分为肢体完全瘫痪,体质量明显减轻,无法进食,四肢拘挛;10分为濒死状态、死亡。造模后次日进行行为学评分,评分的环境与饲养环境一致,放置于具有干净垫料的大笼子中,待大鼠适应新环境后,记录大鼠行为学特征并评分。行为学评分2～8分的大鼠为造模成功,共24只大鼠建模成功。

1.3分组及干预 将建模成功的24只大鼠随机分为上调miR-214-3p组、下调miR-214-3p组、模型组各8只,未行建模的8只正常大鼠为正常组,下调miR-214-3p组腹腔注射antago miR-214-3p 30 mg/kg进行干预。上调miR-214-3p组腹腔注射miR-214-3p 30 mg/kg,正常组、模型组腹腔注射等量生理盐水进行干预。

1.4步幅距离测量 正式步幅试验前,大鼠先行步幅训练3次。装置:木盒子长22 cm,宽18 cm,高12 cm;跑道长44 cm,宽5 cm,高10 cm,将跑道穿过木盒。大鼠前爪涂上黑墨水,跑道上放上白纸,宽5 cm,长44 cm,在放有白纸的跑道上行走,穿过盒子,记录大鼠在白纸上遗留前爪印记前后间的距离,选取3个最长距离,记录。重复测量3次。

1.5悬挂时间测定 正式悬挂开始前,大鼠先行悬挂训练3次。悬挂于直径约3 mm水平铁线上,正常大鼠将前爪悬挂于该铁丝上,肌力越大且越持久悬挂时间越长,放置软垫防止大鼠摔伤。大鼠不能翻坐于铁线,通过前爪悬挂于铁线上,记录抓铁丝线时间,重复检测3次,每次检测间隔2 min以防大鼠疲惫。

1.6各组前额叶皮层苏木素-伊红(HE)染色 大鼠麻醉后,断头取脑,脑组织放置冰盘,取前额叶皮层组织,予0.9%氯化钠溶液洗净组织中血液,吸干,于EP管中,-80 ℃保存备用。组织块固定在切片机标本固定架上,暴露组织最大切面,4 μm的厚度切片。恒温水浴锅内展平裱片,烘片2～6 h,依次浸入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡15 min,完成后依次浸入100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%Ⅰ、95%Ⅱ、90%、80%、70%乙醇溶液中各5 min,后置于蒸馏水中。置于苏木素液中染色20 min,洗去苏木素液,将切片浸入1%盐酸乙醇溶液中,再水洗后流水返蓝30 min。伊红液中染色30 s水洗,以与入水相反顺序乙醇溶液脱水,浸入二甲苯中3 min,中性树胶封片,阴凉处晾干。置于光学显微镜下观察各组前额叶皮层部位组织切片。

1.7miR-214-3p表达检测 脑组织中miR-214-3p的表达采用荧光定量-聚合酶链反应(PCR)检测,取大鼠脑组织,Trizol试剂提取总RNA,逆转录合成cDNA。加入PCR引物,进行qPCR扩增反应,反应条件:94 ℃预变性30 s;94 ℃变性10 s,64 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环。U6为内参照,应用凝胶成像系统(Bio-Rad)摄影,Quantity One软件进行扫描分析,计算采用2-ΔΔCt法。引物序列为:miR-214-3p上游5′-CAGCAGGCACAGACAGGC-3′,下游5′-CTATGTCCTCACCGZZCGCAACC-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.8大鼠炎症因子检测 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脑组织中白细胞介素(IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平,取大鼠脑组织进行组织匀浆,4 ℃离心后收集上清液,应用IL-1、TNF-α和IL-6 ELISA检测试剂盒测定上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6的水平,按照试剂盒说明书进行具体步骤操作。

1.9Western印迹检测Fas/FasL信号通路相关蛋白表达 取出脑组织,对每块进行称重后按12.5 μl/mg加入组织裂解液,充分研磨,静置30 min,4 ℃ 12 000 r/min离心15 min,抽取上清液,加热10 min。-80 ℃冰箱保存,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜。5%脱脂牛奶封闭1 h,加入封闭液稀释的Fas(1∶1 000)、FasL(1∶1 000)、甲状腺激素(TH,1∶1 000)抗体,4 ℃孵育过夜。PBST洗涤3次,加入标记的二抗,室温孵育1 h,PBST洗涤3次,电化学发光(ECL)显影。

1.10统计学处理 采用SPSS26.0软件进行齐性方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组miR-214-3p表达比较 与正常组相比,上调miR-214-3p组、下调miR-214-3p组、模型组miR-214-3p表达明显降低(P<0.05);与模型组相比,上调miR-214-3p组miR-214-3p表达明显升高,下调miR-214-3p组miR-214-3p表达明显降低(P<0.05);与下调miR-214-3p组相比,上调miR-214-3p组miR-214-3p表达明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组miR-214-3p表达、步幅距离、悬挂时间、脑组织中炎症因子比较

2.2miR-214-3p对各组步幅距离、悬挂时间的影响 与正常组相比,上调miR-214-3p组、下调miR-214-3p组、模型组步幅距离明显缩短,悬挂时间明显减少(P<0.05);与模型组相比,上调miR-214-3p组步幅距离明显变长,悬挂时间明显增加,下调miR-214-3p组步幅距离明显缩短,悬挂时间明显减少(P<0.05);与下调miR-214-3p组相比,上调miR-214-3p组步幅距离明显变长,悬挂时间明显增加(P<0.05)。见表1。

2.3miR-214-3p对各组脑组织炎症因子的影响 与正常组相比,上调miR-214-3p组、下调miR-214-3p组、模型组TNF-α、IL-1、IL-6表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,上调miR-214-3p组TNF-α、IL-1、IL-6表达明显降低,下调miR-214-3p组TNF-α、IL-1、IL-6表达明显升高(P<0.05);与下调miR-214-3p组相比,上调miR-214-3p组TNF-α、IL-1、IL-6表达明显降低(P<0.05)。见表1。

2.4各组前额叶皮层HE染色 正常组前额叶皮层区域神经元分布紧密,数量正常,排列整齐,形态较为规整,胞体轮廓清晰,大而圆,空泡变性较少;模型组前额叶皮层区域神经元细胞则较正常组数量较少、排列散裂、胞体轮廓较模糊,胞核固缩与空泡变性较多;下调miR-214-3p组前额叶皮层区域神经元细胞数量减少、排列疏松、胞体模糊,胞核固缩与空泡变性增多,上调miR-214-3p组前额叶皮层部位神经元细胞数有所增加,细胞整体形态与排列情况改善显著。见图1。

图1 各组前额叶皮层变化(HE染色,×400)

2.5miR-214-3p对PD模型大鼠Fas/FasL信号通路相关蛋白的影响 与正常组相比,上调miR-214-3p组、下调miR-214-3p组、模型组Fas、FasL表达较高,TH表达较低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,上调miR-214-3p组Fas、FasL表达较低,TH表达较高,下调miR-214-3p组Fas、FasL表达较高,TH表达较低,差异有统计学意义(P<0.05);与下调miR-214-3p组相比,上调miR-214-3p组Fas、FasL表达较低,TH表达较高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

1～4:下调miR-214-3p组、模型组、上调miR-214-3p组、正常组

表2 miR-214-3p对PD模型大鼠Fas/FasL通路蛋白的影响

3 讨 论

目前,尚未明了PD的致病机制,成功的动物模型制备不仅能够为研究提供良好基础,且可以明确疾病的发病机制〔8～10〕。

miRNA在神经系统中表达丰富,具有明显的组织和细胞特异性,多个miRNA均与PD的发生相关,可能参与并调节PD的发病机制。据报道,miRNA调节的相关系统炎症反应机制也成为PD发病机制研究重点,胶质细胞激活及炎性过程均能对PD的发病和进展起到促进作用〔11～12〕。miR-214-3p在多种肿瘤发生发展中具有重要地位,范文秀等〔13〕研究显示,miR-214-3p的表达可能与卵巢癌的发生、发展有关,故miR-214-3p的表达应该引起相应的重视,以促进早期干预,为生物治疗提供新靶点,阻止病情的发展。步幅试验是评价PD动物模型四肢运动障碍程度的方法,可检测实验动物运动能力,悬挂试验评价PD模型动物在姿势平衡障碍的程度,因此本研究对PD模型大鼠采用步幅试验与悬挂试验的进行评价,以侧面反映PD模型大鼠脑部多巴胺能神经元细胞丢失程度〔14〕。本文研究显示,上调miR-214-3p表达,可有效改善PD模型大鼠步幅距离、悬挂时间,侧面反映miR-214-3p上调可有效改善神经及运动功能。

在PD患者脑内过度的激活引起的神经元丢失及TNF-α等炎症因子的增加。在PD动物模型的中同样有研究发现,小胶质细胞分泌TNF-α引起后续的炎症反应,而抑制小胶质细胞的激活并减少TNF-α的分泌,可以进一步防止神经元的损失〔15〕。研究表明,在雄性大鼠注射脂多糖,可以产生IL-1,IL-6等激活的小胶质细胞,介质的过度释放会导致PD。抑制促炎分子可阻止PD的进展〔16〕。说明在PD的病情发生发展中,炎症因子引起的神经炎症反应发挥着决定性的作用。本研究显示,上调miR-214-3p表达可显著改善PD大鼠TNF-α、IL-6、IL-1表达,通过抑制促炎性细胞因子与程序性黑质的神经元死亡的关系,降低细胞毒性作用,促进神经元恢复。

Fas是属于TNF受体超家族成员的一种跨膜蛋白,它与FasL结合诱导Fas自身的三聚化,然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物。同时,Fas-FasL系统可自行执行Fas介导的凋亡,从而下调免疫应答〔17,18〕。研究发现,Fas/FasL配体相互作用,以自主的方式诱导炎症细胞死亡。Fas通路不仅是重要的凋亡通路,而且与肿瘤发生发展密切相关〔19〕。本文研究显示,miR-214-3p可靶向调控凋亡通路,改善相关蛋白表达,引起细胞骨架重塑和突触形成,诱导细胞分泌金属基质酶,凋亡敏感性增强,有利于机体清除病毒感染的细胞〔20〕,提示上调miR-214-3p改善PD的作用机制可能与Fas/FasL信号通路有关。

综上,miR-214-3p上调对PD大鼠神经功能可有效改善,降低炎症因子,其作用机制可能与Fas/FasL信号通路有关。