NEAT-1、PD-1、ADAM17在中老年HIV感染患者中表达及其与T淋巴细胞亚群的相关性

桂林 何文林 黄远帅 涂业桃 田刚

(1西南医科大学附属医院输血科,四川 泸州 646000;2泸州市疾病预防控制中心;3西南医科大学附属医院医学检验部)

现今对于人类免疫缺陷病毒(HIV)感染中老年患者的治疗方式保持与成人治疗一致性原则,主要通过选择不同机制药物联合治疗进行HIV高效抗逆转录病毒治疗〔1〕。相比于年轻群体,中老年群体机体各功能均有所退化,T淋巴细胞计数降低,因此更容易遭受病毒侵袭,HIV感染率及死亡率更高〔2〕。Liu等〔3〕研究表明,转录本(NEAT)-1在HIV感染靶细胞过程中起重要作用,并且在转录后可调控病毒的表达,NEAT-1与HIV感染具有密切联系。淋巴细胞表面表达的程序性死亡受体(PD)-1通过与其配体PD-1L结合能够负向调节细胞功能,HIV感染可能通过调节PD-1/PD-1L的表达来影响淋巴细胞的成熟〔4〕。任园园等〔5〕研究显示,解聚素-金属蛋白酶(ADAM)17是新近发现的ADAM蛋白家族的成员,可在大多数组织中表达,并在炎症、肿瘤生长和血管生成过程中显著上调,在肿瘤发生和发展过程中发挥重要作用。但有关ADAM17在HIV感染患者机体中的表达及与病情发展的关系研究甚少。本文旨在探究NEAT-1、PD-1、ADAM17在中老年HIV感染患者中的表达及与T淋巴细胞亚群的相关性,为HIV感染治疗提供参考。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2019年1月至2020年1月在西南医科大学附属医院就诊的67例中老年HIV感染患者作为HIV组,病程(20.29±3.21)个月;感染途径:同性传播15例(22.39%)、异性传播30例(44.78%)、注射毒品17例(25.37%)、其他5例(7.46%);合并糖尿病21例(31.34%)、高血压19例(28.36%)、高脂血症27例(40.30%)。选取在医院进行健康体检的53例中老年健康体检者作为对照组进行对比,HIV组年龄50～80岁,对照组年龄50～75岁。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。本研究经医院伦理委员会批准,研究患者及家属均已签署知情同意书。

表1 两组一般资料

1.2纳入及排除标准 纳入标准:HIV组入组患者符合《中国艾滋病诊疗指南(2018版)》〔6〕中对HIV感染诊断标准,患者经检查均为HIV感染症状,且对照组均身体健康无不良症状。排除标准:合并肾脏严重损害者、恶性肿瘤、精神疾病、心脏疾病、心腹功能严重异常者、自身免疫系统疾病者、严重心血管疾病患者、依从性差及不配合治疗者。

1.3NEAT-1、PD-1、ADAM17 mRNA检测 抽取所有患者清晨空腹静脉血5 ml,以离心半径10 cm、转速1 000 r/min离心处理10 min,在-50 ℃环境下保存。采用荧光定量PCR检测NEAT-1、PD-1、ADAM17,在细胞转染24 h后,提取各组细胞总RNA,在测量浓度后,放置在-80 ℃保存,根据逆转录盒步骤进行聚合酶链反应(PCR)扩增,反应条件:85 ℃,2 min;85 ℃,20 min;80 ℃,20 s;30个循环,重复实验3次。引物序列:NEAT-1上游:5′-ACATTTTCCACCTCTGCTTC-3′,下游:5′-TGGCTTCACGTTAGTGACTG-3′;miR-155上游:5′-ACATGTTCCATTCCCCTTTC-3′,下游:5′-CACGTTTATGGCTC TAGTGG-3′;ADAM17上游:5′-ACATCCTCTTCCTTGCATTC-3′,下游:5′-TGAGTTTGCCGTGATCACTG-3′;利用2-△△Ct法计算血清NEAT-1、PD-1、ADAM17 mRNA。

1.4T淋巴细胞亚群检测 采用抗凝全血标本,在Falcon流式样管内置入30 μl T淋巴细胞亚群试剂及50 μl全血,充分混合均匀,放置室温阴暗处20 min后加入10倍稀释流式细胞技术(FACS)溶血素500 μl,放置室温阴暗处10 min。应用muleiTEST自动软件获取淋巴细胞,并分析T淋巴细胞免疫报表,报告显示CD4+与CD8+T淋巴细胞成百分率及CD4+/CD8+比值。

1.5病情严重程度分级 依据《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断》WS293-2019〔7〕,CD4+细胞≥500个/μl为无免疫缺陷,350～499个/μl为轻度免疫缺陷,200～349个/μl为中度免疫缺陷,<200个/μl为重度免疫缺陷。

1.6统计学方法 采用SPSS26.0软件进行方差齐性检验、独立样本t检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1NEAT-1、PD-1、ADAM17水平比较 如表2所示,与对照组相比,HIV组NEAT-1、ADAM17水平均显著降低,PD-1显著升高(P<0.05)。

表2 各组NEAT-1、PD-1、ADAM17及T淋巴细胞亚群水平比较

2.2T淋巴细胞亚群水平比较 如表2所示,与对照组相比,HIV组CD4+细胞降低,CD8+细胞升高,CD4+/CD8+细胞比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3中老年HIV感染影响因素的多元Logistic回归分析 如表3所示,以患者发生HIV感染作为因变量(轻度=0,中、重度=1),将NEAT-1、PD-1、ADAM17、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+细胞作为自变量,纳入二分类多因素Logistic回归分析,结果表明,NEAT-1、PD-1、ADAM17、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+细胞为影响中老年HIV感染的显著因素(P<0.05)。

表3 发生中老年HIV感染影响因素的多元Logistic回归分析

2.4NEAT-1、PD-1、ADAM17与T淋巴细胞亚群之间相关性分析 NEAT-1与CD4+/CD8+比值呈正相关(r=0.022,P=0.004);PD-1与CD4+/CD8+比值之间呈负相关(r=-0.441,P=0.001);ADAM17与CD4+/CD8+比值呈正相关(r=0.362,P=0.001)。

3 讨 论

因HIV感染引起的机体免疫功能缺陷临床无法治愈,可通过药物治疗控制进展,危险性极高〔8〕。根据研究调查,目前全球范围内HIV患病率与死亡率都逐年增长,其我国表明现存活HIV携带者与HIV患者约有85万例,死亡率累积超过30万例〔9〕。HIV主要传播途径为血液、性接触传播及母婴传播〔10〕。研究表明,HIV感染机体后,存在细胞因子的飘移现象而随着病程的发展,细胞因子的表达呈进行性失调对疾病的预后有重要影响〔11〕。本研究表明,NEAT-1、PD-1、ADAM17、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+均与中老年HIV感染及T淋巴细胞亚群相关,可用作于临床预测中老年HIV感染的预测指标。

在机体免疫系统功能中主要为T淋巴细胞由CD4+、CD8+两群细胞组成,其CD4+主要为辅助在HIV感染中的主要靶细胞,当人体免疫功能出现缺陷的主要原因为CD4+数量及功能降低从而引起HIV感;CD8+属于抑制T淋巴细胞,在控制HIV复制过程中起到重要作用;且CD4+/CD8+比值可有效反映中老年HIV疾病状况,并可作为评价HIV感染者免疫系统损害状况最重要的指标〔12〕。

NEAT-1是在细胞核内一种被称为旁斑的结构上,且对旁斑结构的形成及维持具有重要关系,其旁斑主要将持编辑的RNA滞留在细胞核内,因此使基因的表达水平降低〔13〕。根据Peterson等〔14〕研究表明,NEAT-1表达降低可导致病毒的产生,其机制主要是增加HIV-1 mRNA在细胞核到胞质的转运及出核。张喜等〔15〕研究显示NEAT-1在发现时主要作用为肺癌的预后指标,其与许多实体肿瘤有所关联,NEAT-1在细胞核中参与细胞核结构的形成及基因表达过程。随着深入研究发现NEAT-1与一些病毒感染相关,在肾综合征出血热患者的肾组织中高表达〔16〕。本研究发现,NEAT-1在中老年HIV表达量降低,显示NEAT-1的表达与中老年HIV感染有着相对关联,并对HIV疾病发展有着重要影响,但机制表达尚不清楚,需进一步研究分析。

共刺激分子在T淋巴细胞成熟过程中发挥了重要作用,B7-H1是近年来新发现的一类免疫抑制性共刺激分子,与相应受体PD-1结合后能够抑制T淋巴细胞的成熟、削弱T淋巴细胞的免疫应答功能〔17〕。多种病毒感染能够通过PD-1/PD-1L途径来负向协同刺激免疫应答,抑制机体免疫系统对病毒的杀伤作用〔18〕。刘婷婷等〔19〕研究认为,PD-1在HIV感染患者外周血CD3+CD4-T细胞中的表达明显增多且与CD4+T细胞数目、HIV病毒载量有关。本研究发现,中老年HIV组PD-1水平与对照组相比均上升,并且PD-1为影响中老年HIV感染发生因素,且PD-1与CD4+/CD8+比值之间具有相关性,与以上研究结果一致。

ADAM17属于一种金属蛋白酶域的蛋白,其活性的ADAM17主要功能可剪切许多跨膜细胞因子及生长因子的细胞外功能,形成游离的活性形式并激活效应的受体,并在下游信号转导通路中发挥生物学作用〔20〕。崔博翔等〔21〕研究发现,ADAM17在肿瘤中多数为高表达,主要因α转化生长因子形成一条分泌信号转导,其在肿瘤转移过程中参与重要作用。另外有报道显示,ADAM17在乳腺癌组织中的表达量与淋巴细胞转移的数目呈正相关,因此证实ADAM17与乳腺癌的进展有着密切关系〔22〕。本研究结果显示,中老年HIV感染中ADAM17表达量降低,可表明ADAM17活性异常表达增加HIV感染的恶性趋势,但有关ADAM17参与HIV感染的机制尚未明确还需进一步深入研究。