胆总管结石合并胆管细胞癌患者手术前后HER2、Claudin18表达差异性及其与胆管疾病相关性和对预后的影响

马大伟 鲍鸿斌 王亚琳 李宁 徐浩奕

(1衡水市人民医院肝胆胰外科,河北 衡水 053000;2衡水市第四人民医院急诊科)

胆总管结石引发的胆管细胞癌是胆管上皮细胞增生发展为不典型增生及腺癌样癌变的过程〔1〕。胆管细胞癌包括起源于胆管上皮的所有肿瘤,多数胆管细胞癌为腺癌,可分为肝内胆管细胞癌和肝外胆管细胞癌两大类〔2〕。研究显示,肝内胆管细胞癌是肝胆内管被覆上皮形成的原发性癌,病理机制及原因尚不明确,但与胆管疾病具有相关性〔3〕。由于肝内胆管细胞癌的特殊位置及较高的恶性程度,导致其死亡率较高,手术治疗效果不理想,因此早期诊断和预防尤为重要,近年来探索新的诊断和预后相关因子已成为诊断和治疗胆管细胞癌的研究重点〔4〕。人表皮生长因子受体(HER)2是一种糖蛋白,研究显示其在肺癌、乳胃癌等多种癌症中高表达,有望成为鉴别恶性肿瘤的新型指标〔5〕。Claudin-18是细胞间紧密连接结构的骨骼蛋白,众多的研究已经证实其与肺癌、胃癌等癌症存在密切关系〔6〕。但HER2和Claudin-18在胆管细胞癌中的相关研究尚无报道,推测其可能与胆管细胞癌存在关系。本研究探讨HER2和Claudin-18在胆总管结石和胆管细胞癌患者手术前后的表达差异性及其与胆管疾病的相关性和对预后的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年6月至2018年6月在衡水市人民医院肝胆外科接受肿瘤手术治疗的胆总管结石合并胆管细胞癌患者50例为胆管癌组,患者均经病理检查确诊,其中男26例,女24例,平均年龄(62.3±10.2)岁。单纯胆总管结石患者50例为胆总管结石组,男23例,女27例,平均年龄(61.5±11.4)岁。同期体检健康者50例为健康组,男27例,女23例,平均年龄(62.8±10.5)岁。按照2019年版世界卫生组织(WHO)胆管细胞癌组织学分级,高分化15例,中分化13例,低分化22例;Ⅰ～Ⅱ级19级,Ⅲ～Ⅳ级31级。研究对象均知情同意。纳入标准:(1)临床诊断符合胆总管结石合并胆管细胞癌〔7〕,并经病理诊断确诊;(2)术前未进行化疗、放疗治疗;(3)预期生存时间≥3个月;(4)临床资料完整。排除标准:(1)伴有各脏腑器官及脑血管、血液等严重疾病者;(2)患有其他肿瘤者。本研究已通过医院伦理委员会批准。

1.2检测外周血HER2 和Claudin-18 采集两组患者术前和术后空腹1 w血液3～5 ml,离心后获取血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)检测HER2 和Claudin-18蛋白表达。

1.3免疫组化法检测组织中HER2 和Claudin-18表达 获取术中胆总管结石合并胆管细胞癌患者癌组织及癌旁组织样本、胆总管结石患者的胆管组织。样本处理:HER2多克隆抗体(美国Dako公司),SP法免疫组化试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)。石蜡切片脱水,加3%H2O2室温静置10 min去除内源性过氧化酶,磷酸盐缓冲液(PBS)漂后柠檬酸热抗原修复,PBS漂洗3×5 min;加入山羊血清,2 h后,漂洗2次,加一抗(1 μg/ml),4 ℃孵育过夜,再漂洗3×5 min,加二抗,经室温孵育,漂洗后,加入二氨基联苯胺(DAB)染色液,显微镜下观察,苏木素复染,脱水,透明,封片。采用Formwitz半定量积分法,光学显微镜下每张切片随机选取5个100倍视野,计数阳性细胞并观察染色强度。0分:阳性细胞比率≤5%,染色强度无色。1分:阳性细胞比率6%～25%,染色强度淡黄色。2分:阳性细胞比率26%～50%,染色强度黄色。3分:阳性细胞比率51%～75%,染色强度棕黄色。4分:阳性细胞比率>75%。总分为阳性细胞比率与染色强度评分之积:阴性0分,标记为(-);弱阳性1～4分,标记为(+);中等阳性5～8分,标记为(),强阳性9～12分,标记为();低表达0～8分,高表达9～12分。

1.4Western印迹检测HER2 和Claudin-18蛋白表达 提取蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白量,电泳转膜后,5%脱脂奶粉室温封闭2 h,加入羊抗人Claudin-18、HER2(1∶500)多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),稀释1∶1 000的β-actin单克隆抗体,4 ℃孵育过夜,PBST洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗羊IgG(北京博尔西科技有限公司),二抗室温孵育2 h,PBST洗涤后显色、曝光、显影、定影。实验重复2次。

1.5术后随访 术后每3个月对患者随访1次,随访最长时间为3年,记录患者生存时间,有无转移等,统计存活率并进行生存分析。

1.6统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验、χ2检验、Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1各组血清中HER2和Claudin-18水平(P>0.05) 术前及术后观察组血清HER2和Claudin-18水平显著高于术前及术后对照组和健康组(P<0.05);健康组与对照组术前、术后及组间比较水平无显著差异(P>0.05)。术后观察组血清HER2和Claudin-18水平显著低于术前(P<0.05),见表1。

表1 各组手术前后血清HER2和Claudin-18水平比较(n=50,μg/L)

2.2两组组织中HER2和Claudin-18阳性率比较 癌组织中HER2和Claudin-18阳性率(94.0%、92.0%)显著高于胆管组织(8.0%、6.0%)及癌旁组织(10.0%、8.0%;均P<0.05),癌旁组织与胆管组织间阳性率比较无显著差异(P>0.05)。见图1。

图1 各组织中HER2和Claudin-18表达(免疫组化,×200)

2.3胆管细胞癌患者HER2、Claudin-18与临床病理的相关性 HER2、Claudin-18表达水平与性别、年龄无显著相关性(P>0.05),与组织学分级、血管浸润程度、淋巴结转移程度呈正相关(r=0.621、0.322、0.628,均P<0.05),与细胞分化程度呈负相关(r=-0.372,P<0.05)。HER2与Claudin-18具有正相关关系(r=0.723,P<0.05)。经检测胆管细胞癌患者HER2高表达34例,低表达16例,Claudin-18高表达37例,低表达13例。HER2、Claudin-18表达水平在性别、年龄方面无显著差异(P>0.05),在组织学分级、分化程度、血管浸润程度、淋巴结转移方面差异明显(P<0.05)。见表2。

表2 胆管细胞癌患者HER2、Claudin-18高表达与临床病理的相关性(n)

2.4Western印迹检测不同分化程度胆管细胞癌组织中HER2、Claudin-18蛋白表达 不同分化程度的胆管细胞癌组织HER2、Claudin-18表达显示,低分化表达显著高于中分化,中分化显著高于高分化(P<0.05)。见表3。

表3 不同分化程度胆管细胞癌组织中HER2、Claudin-18蛋白表达

2.5胆管细胞癌患者HER2、Claudin-18与预后关系 术后随访3年,HER2高表达34例,死亡13例,低表达16例,死亡1例。Claudin-18高表达37例,死亡13例,低表达13例,死亡1例。与低表达患者相比,高表达HER2、Claudin-18患者生存时间显著较短(P<0.05)。见图2。

图2 胆管细胞癌组织中HER2、Claudin-18表达与预后关系

2.6影响肝内胆管细胞癌患者预后的危险因素 针对胆管细胞癌患者相关临床指标:HER2、Claudin-18、胆总管结石、胆囊结石、肝硬化、脂肪性肝炎进行Logistic回归分析显示,HER2、Claudin-18、肝硬化、胆总管结石是肝内胆管癌发病的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 胆管细胞癌患者发病的危险因素Logistic回归分析

2.7灵敏度、特异性曲线 HER2、Claudin-18的受试者工作特征(ROC)曲线分析显示,HER2、Claudin-18曲线下面积分别为0.874(0.794～0.954)、0.977(0.970～0.984),具有很高的检测灵敏度(P<0.05)。见图3。

图3 HER2、Claudin-18检测对胆管细胞癌诊断的ROC曲线

3 讨 论

胆总管结石易致胆汁滞留且常伴有不同程度的胆管机械性损伤或感染进而引起慢性炎性增生不典型增生甚至发展为胆管细胞癌变。胆总管结石合并胆管细胞癌预后极差,患者在发现时往往已属晚期〔8〕。手术治疗是胆总管结石合并胆管细胞癌的有效方式,手术可将癌组织结石同时去除,减少复发可能性,延长术后生存时间。研究显示,早发现胆管细胞癌对于治疗方案的制定和时机把握及预防术后复发有重要意义〔9〕。HER2、Claudin-18在很多肿瘤组织中表达水平升高,并与预后存在相关性,本研究结果表明,HER2、Claudin-18在胆管细胞癌的病情中存在表达差异,可能与病情发作存在关系。

HER2在细胞分裂增殖及信号跨膜转导中具有重要作用,其扩增和过度表达与人类癌症和转移有关〔10〕。HER2的扩增是肿瘤侵袭性的一个因素,其与更频繁的复发和较差的生存率相关〔11〕。也有研究发现,在超过1/4的转移性乳腺癌中HER2受体过度表达〔12〕,另外也有很多研究发现,卵巢癌、胃癌等多种癌症中HER2表达增强。本研究结果提示,HRE2可能参与了胆管细胞癌的病情发展。Claudin蛋白是一类参与构成细胞紧密连接的细胞表面分子,共包含了27种亚型,Claudin-18是其中之一,其功能主要为维持细胞间黏附调节细胞旁通透性维持细胞极性〔13〕。研究显示,Claudin-18蛋白在局部差异性表达将会造成细胞屏障功能的改变,在肿瘤发生和迁移过程中发生作用〔14〕。研究显示,在胃癌组织中Claudin-18蛋白表达降低并与转移程度呈负相关〔15〕,在胆管组织中Claudin-18表达高于健康组织〔16〕。本研究结果提示,Claudin-18可能参与了胆管细胞癌的发生和发展。由以往研究及本研究结果可见,HETR2、Claudin-18可能参与了肿瘤的发生、侵袭、转移等过程,并在多种癌细胞的细胞膜表面表达,这使其成为靶向治疗靶点研究的重要指标。

当前诱发胆管细胞癌公认的危险因素有胆管结石、寄生虫感染、胆管炎等,而针对胆管细胞癌的预后的危险因素研究显示,有淋巴及远处转移的患者,其预后明显差于无转移的患者〔17〕,肿瘤的分化程度也与预后明显相关〔18〕。研究发现,HER2在大约15%的浸润性乳腺癌中过度表达和扩增,是抗HER2药物反应的分子靶点和预测标记〔19〕。Claudin-18在胰腺癌中阳性表达率>96%,且随分化程度升高表达显著升高,在上皮病变中可达98%〔20〕。本研究结果提示,HER2、Claudin-18与胆管细胞癌的发生发展存在密切的关系、也有其他研究报道HER2的过表达与病理分期、浸润深度、淋巴结转移和肿瘤大小有关〔21,22〕,有关Claudin-18蛋白的研究显示,其可参与肿瘤细胞的转移,并在增殖和分化凋亡过程中发挥了重要作用〔23〕,这与本研究结果相似。但有报道发现,Claudin-18在肺腺癌中的表达与年龄、淋巴结转移均无关〔24〕,这与本研究结论存在一定差异,可能原因为Claudin-18在不同癌症中的异质性差异所致,需要进一步研究。

研究表明,HER2与多种肿瘤的预后不良因素有关,其是胃癌、乳腺癌、肠癌等恶性肿瘤的独立危险因素〔25,26〕,而Claudin-18在进展期胃印戒细胞癌(SRCC)患者中高表达,其在原发性胃癌和进展期胃SRCC中的表达差异有显著性(77% vs 95.24%),提示以Claudin-18为基础的靶向治疗在进展期胃SRCC的治疗中具有很大的潜力〔27〕。本研究结果提示,HER2、Claudin-18表达可影响患者预后生存时间,二者可能在胆管细胞癌患者的预后中发挥作用。这为胆管细胞癌的预防提供重要参考价值,另外通过灵敏度曲线分析显示,检测HER2、Claudin-18具有很高的敏感度,对胆管细胞癌早期检测有指导意义。

综上,HER2和Claudin-18与肝外胆管细胞癌的发生发展有关,其可能成为其临床预后的预测指标。