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产胞外多糖乳酸菌的筛选与体外益生特性评价

2023-10-08张晓雨韦云路

现代食品 2023年14期
关键词:株菌胞外菌体

◎ 李 悦,陈 静,张晓雨,刘 义,韦云路

(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川 绵阳 621000;2.贵州食品工程职业学院,贵州 贵阳 550000)

胞外多糖(EPS)是乳酸菌向周边环境产生的高分子化合物,主要由糖和糖的衍生物组成[1],长期以来一直被安全地用于食品工业[2]。由于LAB通常被认为是一种安全的食品微生物,纯化的LAB和EPS可以直接用于乳品行业,作为商业乳化剂和增稠剂的替代品,以改善酸奶的黏度、质地和风味[3,4]。然而,虽然人们普遍认识到了LAB与EPS的各种好处,但只有少数产品已经商业化和工业化生产。

分离能够产生活性EPS的天然乳酸菌株,是广泛使用和应用乳酸菌的先决条件。发酵食品大多是由乳酸菌发酵而成,可以作为产胞外多糖乳酸菌的重要来源[5]。研究者发现一种土耳其饮料,以植物乳杆菌为主要菌种,并从天然发酵的青橄榄汁中筛选了17个以上的菌株[6-9]。

研究表明,产生胞外多糖的乳酸菌和发酵剂的结合,可以增加酸奶的黏度和改善口感,而酸奶的黏度主要由形成胞外多糖的数量及结构决定[10-11]。Helen等[12]人提出,产胞外多糖乳酸菌在提高发酵乳硬度方面具有一定效果,且EPS产量越高,制品硬度越小。随着稳定剂在欧洲被禁止使用,出现了不使用添加剂的天然食品[13]。

本研究采用四川特色传统发酵食品腊肉与泡菜作为原材料,筛选并鉴定高产胞外多糖乳酸菌菌株,且对其抗氧化性与自聚集能力进行评价,以期为开展高产胞外多糖乳酸菌的开发与研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料:自然发酵的泡菜、四川农家自制腊肉。

培养基:MRS固体培养基、MRS液体培养基,北京陆桥技术公司。

试剂:胰蛋白酶,北京瑞达恒辉科技发展有限公司;浓硫酸、二甲苯、酚酞、过氧化氢、无水乙醇,成都金山化学试剂。

1.2 仪器与设备

TOMY SX-700立式高压蒸汽灭菌锅:樱美迪生物科技(上海)有限公司;SW-CJ-1F水平流洁净工作台:苏州安泰空气技术有限公司;SPX-250-B-Z微生物恒温培养箱:上海博讯实业有限公司;UV-5800PC紫外分光光度计:上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分离、纯化

取5 g产品进行处理,利用梯度稀释将浓度降到10~5。每个梯度于MRS琼脂上涂覆,置于37 ℃培养24~48 h。从平板上选取具有不同特征的单个菌落,对其展开分离和纯化,反复进行以上步骤,直至产生纯菌落,然后将所得的单一菌株进行排序,甘油保藏[14]。

1.3.2 菌株的筛选

1.3.2.1 菌株自聚集实验

参考SON等[15]的方法作适当修改,将乳酸菌菌株5 000 r/min,离心10 min收集,利用PBS缓冲液洗涤菌体2次,PBS缓冲液重悬菌体用测OD600并调至1.0,于37 ℃培养箱中静置2 h,取0.1 mL上层悬液加入1.9 mL的PBS中测定OD600。

1.3.2.2 乳酸菌胞外多糖的提取

根据刘滔[16]和陈东[17]的方法做了修改, 3%接种量接种于MRS中, 37 ℃发酵24 h,离心(5 000 r/min、25 min)取上清液,加入三氯乙酸使其浓度为4 %, 4 ℃静置过夜,离心(5 000 r/min、20 min)取上清液,加入3倍体积无水乙醇, 4 ℃静置过夜,离心(5 000 r/min、20 min)去上清液,用蒸馏水使其溶解,在4 ℃下透析2 d,冷冻干燥,称重量。

1.3.3 菌株的鉴定

(1)乳酸菌的16S rDNA 基因序列测定

由专业公司测序,将测序后获得的16S rDNA基因序列递交美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库;使用搜索工具(BLAST)进行同源性比对,对序列一致性分析[18]。

(2)乳酸菌细胞形态观察

将筛选出的3株乳酸菌培养24 h,随后用革兰氏染色法对目标细菌的形态进行观察。

1.3.4 菌株的体外益生特性

1.3.4.1 DPPH自由基清除率的测定

吸取不同发酵时段的发酵上清液2 mL于10 mL试管中,每支试管加入2 mL 、2×10-4mol·L-1的DPPH溶液,将其振荡均匀,在黑暗处放置30 min,取上清液,测定波长为517 nm的吸光度。实验设空白组、对照组、实验组[19-20]。

式中,A1是DPPH溶液与被测定的液体的吸光度;A2是无水酒精与被测定的溶液的吸光度;A0为DPPH溶液与无水酒精的吸光度值。

1.3.4.2 乳酸菌细胞表面疏水性的测定

利用BATH测定细胞表面疏水性:取菌液5 mL于离心管,离心(3 000 r/min 、10 min)收集菌体。用5 mL的PBS缓冲液清洗两次,以 PBS缓冲液作空白对照,用其调节OD600为1.00 nm,取4 mL于离心管内,添加二甲苯0.8 mL,对照组未添加,震荡30 s后放置10 s,再次震荡30 s,静置10 min待分层。测水相测定OD600nm值[21]。

式中,A0是与二甲苯混合前菌液OD值;A是与二甲苯混匀后菌液 OD值。

2 结果与分析

2.1 分离结果

从四川传统的发酵食品样品中,分离纯化出大约40株的乳酸菌单菌落,其固体培养基的形态,菌株均为白色,形状为圆形,且表面湿润和凸起,可以明显分辨为乳酸菌单个菌落。其中,由泡菜筛选的菌株编号为P1-25,腊肉编号为L1-15,分离到的乳酸菌均采用甘油进行菌株保藏,以备后续试验。

2.2 菌株的筛选及鉴定

2.2.1 菌株的筛选

2.2.1.1 自聚集能力

采用整群随机抽样的方法,从某省某高校二年级学生中选取120名非英语专业大学生为调查对象。其中男生57名,女生63名。

对筛选的乳酸菌进行培养,形成单菌落,初步观察其菌落形态后,选取菌落较大、黏稠的菌株,并进行自聚集能力测定,测定结果显示自聚集率最高的10株乳酸菌,分别为P2、P6、P10、P12、P15、P16、P18、P19、L2、L6(如表1所示)。

表1 菌株自聚集能力表

2.2.1.2 高产胞外多糖乳酸菌的筛选

将2.2.1.1中所得的10株菌进行培养并提取胞外多糖后经真空冷冻干燥,获得的乳酸菌胞外多糖样品颜色为淡黄色或乳白色,结构呈现疏松多孔的形态;对每株菌产生的EPS进行称重,筛选出来的3株高产胞外多糖乳酸菌菌株分别是P2、P6、P19(如表2所示)。

表2 菌株多糖产量表

2.2.2 菌株的鉴定

2.2.2.1 乳酸菌的16S rDNA 基因序列

将从四川传统发酵食品中获得的高产胞外多糖乳酸菌送公司鉴定,结果如表3所示,分别为P2(Leuconostoc mesenteroides)、P6(Lactobacillus sakei)、P9(Weissella viridescens)。

表3 菌株16S rDNA的测序结果表

对3株高产胞外多糖的乳酸菌进行革兰氏染色,结果见图1,所有的细菌都是革兰氏阳性,并且细胞形态呈现长杄、短杄、棒状、球状、细长形,无分枝。

图1 显微镜下菌株细胞形态图

2.3 乳酸菌益生特性

2.3.1 乳酸菌DPPH自由基清除能力

用 DPPH自由基清除速率来评估乳杆菌的抗氧化性。如图2所示,乳杆菌发酵液具有一定的抗氧化活性,数据显示,在乳酸菌的发酵过程中,3株菌的DPPH自由基清除率均随着时间的延长而增长,30 h后,P2和P6有降低趋势,清除率最低的是P2;18 h前,P19的清除能力最强;18h后,P19和P6对DPPH自由基的清除能力相当。

图2 乳酸菌DPPH自由基清除能力图

2.3.2 乳酸菌菌株的表面疏水性

在益生菌的体外筛选过程中,菌体的疏水度反应了菌体在生物体内的定殖能力。本研究分别对筛选到的乳酸菌菌株P2、P6、P19的表面疏水性进行测定,结果由表4可知,各种类型的乳酸菌对二甲苯具有不同的吸附量。其中,P19的疏水率大于90 %,对二甲苯有较好的吸附性;P2、P6两种材料的疏水性均低于50%,对二甲苯的吸附性比较差。

表4 菌株表面疏水性测定结果表

3 讨论

本研究从四川传统的发酵食物泡菜和腊肉中分离出乳酸菌,并且进行筛选,筛选出的乳酸菌单菌落形状与陈东[17]等筛选出的乳酸菌菌落特征一致,初步认定为乳酸菌。在此基础上,本研究对所获取的17株通过自聚集进行筛选,结果表明,这17株乳酸菌的自聚集能力较强,均在90 %以上,说明所筛选的乳酸菌可快速繁殖、自行聚集成团,这一结果与陈孝勇[22]等在牦牛酸乳中选择出的乳酸菌结果相似。随后,本研究对自聚集能力较强的菌株进行胞外多糖产量的测定,得到P2、P6、P19菌株,并运用16S rDNA鉴定菌株,二者16S rDNA序列同源性均大于97.5%,表明二者为同种,这与陈明霞[23]等的研究结果相似。本研究最终筛选出的3株菌在NCBI数据库中进行BLAST相似性对比。其中,P2为Leuconostoc mesenteroides、P6为Lactobacillus sakei、P19为Weissella viridescens。随后将这3株乳酸菌进行革兰氏染色并在显微镜下观察,可以看见明显的紫色,为革兰氏阳性菌,形态观察与16S rDNA鉴定结果一致。

乳酸菌的抗氧化能力能够帮助机体维持相对稳定的状态,本研究表明,3株菌株的自由基清除能力均随着发酵时间增加而增强,30 h后P2和P6有降低趋势。由此可见,选择适当的发酵时间,对于提高乳酸菌的抗氧化能力具有重要作用。

菌体的疏水度反应了菌体在生物体内的定殖能力,本研究中,P19的疏水率大于90 %,P2、P6两种材料的疏水性均低于50%。国内学者从四川传统干酪中筛选得到乳酸菌菌株N-4的疏水性达21.37%,筛选的降胆固醇乳酸菌 ZG2YLu05疏水性为 46.82%[25-26]。与上述研究结果相比,3株菌的优势明显,可见其具有明显的肠道定殖潜力。

4 结语

本研究从四川传统发酵食品中共分离筛选出3株高产胞外多糖乳酸菌,分别是P2、P6、P19,其产量分别为0.140、0.124、0.128 g/L,鉴定为Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus sakei、Weissella viridescens。在益生特性评价中,P2的抗氧化能力较弱,但对DPPH自由基的清除能力最弱;P19和P6抗氧化能力较强,对DPPH自由基的清除能力18 h后相当,18 h前P19的清除能力最强。此外,3株菌的表面疏水性有所不同,其中,P19的疏水率高于90%,这表明3株菌有在肠道定殖的潜力。因此,本研究结果表明,3株菌均有开展益生性能与胞外多糖研究的价值,可以为后续探究奠定基础。

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