竹黄菌角质酶Sb_5623的生物信息学分析及其原核表达

◎ 王 珞 ，罗 可 ，任锡毅

（1.贵州省生物技术研究所，贵州 贵阳 550006；2.贵州省农业生物技术重点实验室，贵州 贵阳 550006）

竹黄菌（Shiraia bambusicola）是一种罕见的药用真菌，隶属于子囊菌门，常寄生于竹子的嫩枝，大量发生会导致竹子衰败死亡。竹黄菌可寄生于包括刚竹属（Phyllostachys）、箭竹属（Fargesia）在内的10多种竹子，但其仅生长在超过一年生的枝条上，具有明显的组织特异性[1-2]。竹黄菌自然生长周期短，对光照、温度、湿度等条件要求较高，室内培养难以形成子实体和孢子[3]。对竹黄菌基因组的组装、转录组与代谢组的分析[4]，可以为竹黄菌基因功能的研究奠定基础。

角质酶是属于α/β水解酶超家族的丝氨酸酯酶，可以通过水解单体之间的酯键来分解角质聚酯。角质酶来源广泛，在植物花粉、真菌和少量原核生物中均有表达[5]。真菌角质酶是一种诱导酶，病原真菌能够通过分泌角质酶降解植物细胞的角质或栓质，从而突破植物表面屏障，削弱宿主抗性[6]。病原真菌的休眠孢子含有“组成型”角质酶，以空间定位的方式从宿主植物角质层释放少量角质，破坏植物表面角质层。在灰霉菌、镰刀菌、弯孢菌、稻瘟病菌和炭疽菌的休眠孢子中，均在感染早期检测到组成型表皮酶活性。这些孢子粘附在寄主植物表面，并从角质层释放对感染后续阶段至关重要的角质单体，在侵染过程中发挥关键作用。

本研究以竹黄菌为材料，构建了角质酶Sb_5623基因原核表达载体pET28a_5623，在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白并进行纯化，以期为后续角质酶Sb_5623的功能研究提供蛋白材料与科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Sb_5623序列由竹黄菌基因组数据中获得[3]；原核表达载体pET28a_5623由武汉擎科生物科技有限公司构建；感受态E.Coli BL21购于武汉擎科生物科技有限公司。

硫酸卡那霉素（Kan）、异丙基β-D 硫代半乳糖苷（IPTG）、十二烷基磺酸钠（SDS）、丙烯酰胺、过硫酸铵及甲醇等，均购自索莱宝生物科技有限公司。

1.2 Sb_5623生物信息学分析

利用在线软件InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）预测蛋白结构；通过在线程序SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM（http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白信号肽位点和跨膜结构域。

1.3 重组蛋白的诱导表达与纯化

参照已建立的原核表达与Ni-NTA诱导纯化的方法[7]，将重组载体转入大肠杆菌感受态BL21，设置IPTG的诱导浓度为0.2 mM，设置不同的温度梯度，摸索出重组蛋白诱导表达的最适条件、探索纯化蛋白的最适上清洗脱条件。

1.4 Western Blot鉴定重组蛋白

根据 Western Blot 操作步骤，诱导后蛋白先于15% SDS-PAGE 跑胶，然后100 V 80 min 恒压转移至PVDF 膜上；1×PBST 溶液洗膜4次，每次4 min；PVDF膜封闭30 min； 1×PBST溶液洗膜4次；带His标签的一抗低温孵育过夜；1×PBST清洗；二抗常温孵育1 h；电化学发光法显色，全自动荧光化学发光成像系统成像。

2 结果与分析

2.1 角质酶Sb_5623蛋白生物信息学分析

通过InterPro对Sb_5623蛋白进行结构域预测，发现其第37至第255个氨基酸的位置含一个Cutinase角质酶结构，属于α/β水解酶超家族（AB_hydrolase）；而1～27个氨基酸的位置存在一段信号肽（如图1）。

图1 Sb_5623蛋白保守结构域预测图

根据信号肽位点预测的结果，可见Sb_5623的信号肽属于Sec/SPI类型，即由Sec转座转运，并且由信号肽酶I（Lep）切割的标准型分泌信号肽，概率为0.974 6。此信号肽的剪切位点预测在第19个和第20个氨基酸之间，概率为0.467 6（如图2A）。

图2 角质酶Sb_5623生物信息学分析图

Sb_5623蛋白共计324个氨基酸，有一个跨膜螺旋结构，大部分序列在膜内，其余序列在膜外，跨膜螺旋中氨基酸预期数量为22个，推测该蛋白属于分泌蛋白（如图2B）。

2.2 Sb_5623重组蛋白诱导表达

设置蛋白诱导得到IPTG浓度为0.2 mM，诱导条件为过夜诱导，设置18、28、37 ℃3个温度梯度，探究蛋白诱导的最适温度。经过SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果发现，在33～43 kd之间有目的带大小的条带，但是诱导前后不明显，且沉淀中的表达量多于上清中（如图3A）。为了确认该条带是否为目的带以及融合蛋白是否表达成功，利用带His标签的抗体，通过western blot实验检验蛋白表达，结果表明，不同温度条件下，沉淀中均有Sb_5623重组蛋白表达，但仅在18 ℃诱导条件的上清中，出现Sb_5623蛋白表达（如图3B）。沉淀中Sb_5623蛋白表达量多于上清中，但上清中蛋白表达条带单一，产物干净。

图3 Sb_5623蛋白分子原核表达图

2.3 Sb_5623重组蛋白纯化分析

将18 ℃诱导后的上清液使用Ni-NTA 亲和层析纯化分析，经过不同浓度的咪唑洗脱后，结果表明，250 mmol/L咪唑洗脱出来的目的蛋白能够洗脱下大部分的杂带，纯度较高，可对其进行收集。该蛋白具备生物活性，后续可用于抗体及材料制备，深入研究Sb_5623的基因功能（如图4）。

图4 Sb_5623蛋白分子纯化分析图

3 结语

本研究对竹黄菌Sb_5623基因的编码蛋白进行了生物信息学预测，发现其编码一个隶属于α/β水解酶超家族的角质酶，在病原真菌侵染寄主植物时起着关键的作用。通过信号肽预测与跨膜结构预测发现，Sb_5623存在信号肽区段与跨膜结构域，该蛋白推测属于分泌蛋白。随后，本实验构建了原核表达载体pET28a_5623，经IPTG诱导后，发现在18 ℃诱导过夜的条件下，上清中出现了条带单一的重组蛋白，随后对上清液进行纯化分析，在250 mM咪唑的洗脱条件下，得到了纯度较高且具备生物活性的目的蛋白。因此，本文可以为竹黄菌角质酶Sb_5623的蛋白结构解析与基因功能研究提供参考。