核桃不同部位单宁含量测定方法研究

林 淼 杨海锋 时文兴 刘海燕

（上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403）

核桃（Juglans regiaL）又称胡桃、羌桃、万岁子等，在我国具有悠久的栽培历史。我国核桃资源丰富[1]，主要分布在云南、山西、四川、河北等省。核桃不同部位有很高的营养价值和经济价值。青皮是核桃和胡桃楸的未成熟外果皮，为民间常用中药，含多种活性成分[2]；核桃分心木是指核桃内的木质隔膜，具有强肾固精和补益气血等功效[3]；核桃种仁外有一层种皮，呈黄色或浅黄色，具有防止种仁氧化酸败，保持采后品质的功效[4]。然而在生活中，除果肉外，核桃其他部位大多被当作废弃物处理，造成了资源的浪费，如能将其作为副产品资源化利用，不仅可以减少废弃物产生、保护环境，也能带来经济效益。植物单宁，是一种高度聚合的多酚化合物，具有抗氧化功能和抑菌作用，同时对慢性病有预防作用[5]。探讨核桃中单宁的提取与测定方法，对促进核桃单宁成分利用具有重要意义[6]。目前常见的检测方法有EDTA 滴定法、磷钼酸-钨酸钠比色法、毛细管气相色谱和六氰合铁（III）酸亚铁钾分光光度法等[1，7-11]。上述方法或使用的试剂对身体和环境有害，或需要用到大型精密仪器，操作复杂，价格较高。本试验应用二甲基甲酰胺比色法快速检测核桃中单宁含量，该方法简便快捷，灵敏度高，结果较准确。

1 材料与方法

1.1 试验原理

利用二甲基甲酰胺提取核桃不同部位的单宁，提取、离心后加入显色剂显色，同时做空白对照，再用分光光度计于525 nm 测定待测液的吸光度值，以单宁酸作标准曲线测定核桃不同部位的单宁含量。

1.2 仪器与试剂

仪器主要有分光光度计（8453 型，安捷伦公司）、高速离心机（ST16R型，Therom公司）、电子天平（AL204-IC型，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）、涡旋混合器（美国Talboys公司）、粉碎机（DFT型，上海鼎广机械设备有限公司）。单宁酸标准品（CAS号1401-55-4，纯度≥98%）；75%二甲基甲酰胺溶液，取75 mL二甲基甲酰胺溶液，加20 mL水稀释，待冷却后定容至100 mL；3.5 g/L 柠檬酸铁铵溶液，称取0.35 g 柠檬酸铁铵，用水溶解并定容至100 mL；氨水溶液，移取3.2 mL氨水，定容至100 mL。核桃样品采集自云南临沧市，分别剥取核桃青皮、核桃种仁、内种皮、分心木待测。

1.3 试验方法

1.3.1样品前处理取适量代表性试样，用样品粉碎机粉碎，将样品装于密封容器中，制成待测样，0～20 ℃保存备用。称取核桃各部位试样1 g（精确至1 mg）至50 mL 离心管中，准确加入20.0 mL 75%二甲基甲酰胺溶液，2 500 r/min 涡旋提取15 min，提取完毕后转速3 000 r/min离心15 min。取上清液备用。

1.3.2标准溶液配制准确称取单宁酸200 mg标准品（精确至0.1 mg），用水定容至100 mL。该标准溶液中单宁酸的质量浓度为2 mg/mL，4 ℃冰箱密封保存，有效期7 d。分别移取该溶液0、1.0、2.0，3.0、4.0 和5.0 mL，并用柠檬酸铁铵溶液定容至20 mL，配制的单宁酸标准溶液的浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL。

1.3.3试样溶液测定依据单宁含量的高低，移取上清液1.0 mL。每个试样取2 份：1 份准确加入7.0 mL 水、1.0 mL 3.5 g/L 柠檬酸铁铵溶液，用涡旋仪涡旋几秒后加入1.0 mL 氨水溶液（取3.2 mL 氨水，定容到100 mL，下同），再涡旋几秒。另外一份待测液做样品空白，直接加入8.0 mL水和1.0 mL氨水溶液，涡旋几秒钟，用作试样空白测定。若样品试液测定浓度超过标准曲线范围，则需将样品待测液稀释合适的倍数后重新测定。试样的吸光度值测定结果为试液测定吸光值与试液空白测定吸光值两值之差。

1.3.4标准曲线绘制分别移取单宁酸标准系列标准溶液各1.0 mL，准确加入7.0 mL水、1.0 mL 3.5 g/L柠檬酸铁铵溶液，用涡旋仪涡旋几秒后加入1.0 mL氨水溶液，再涡旋几秒。静置（10±1）min，用分光光度计于525 nm测定吸光度值。以水作为空白对照。以标准溶液中各吸光度值作为纵坐标，相应的单宁酸浓度作为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.5样品中单宁含量的计算样品中单宁含量的计算公式如下。

式中：w为试样中单宁的含量（%）；c为从标准曲线上查的单宁酸的浓度（mg/mL）；V为试样测定液定容体积；f为试样溶液稀释倍数；m为试样的质量（g）。

2 结果与分析

2.1 样品处理条件的优化

传统的单宁提取一般采用震荡、超声提取等方法，本试验尝试使用涡旋提取，取得较好的提取效果。

2.1.1样品提取方式优化本试验用震荡提取、超声提取和涡旋提取方式对核桃各部位的单宁进行提取，并对3 种方式的提取效率进行分析。试验结果表明，在提取时间均为20 min的情况下，涡旋提取效果良好，结果见表1。

表1 不同提取方式下样品单宁含量单位：%

2.1.2样品提取时间的考察涡旋提取时间对单宁的提取率有影响，因此选取5 个不同的提取时间对样品单宁提取并测定。结果表明：在2 500 r/min的最大涡旋速度下，当提取时间为10 min 时样品单宁含量最大，为保证对样品中的单宁提取完全，应将提取时间定到15 min，结果见表2。

表2 不同提取时间下样品单宁含量单位：%

2.2 线性范围测定

将浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mg/mL 的单宁酸标准溶液进行分光光度测定，以目标物浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。单宁酸标准曲线为Y=1.259 1X+0.182 5，相关系数为0.999 4，该曲线表明，在0～0.5 mg/mL 范围内，单宁酸具有良好的线性关系。

2.3 检出限与定量限

对浓度0.000 1～0.100 mg/mL 的单宁酸标准品进行测定（扣除试剂空白）。在单宁酸浓度为0.005 mg/mL时，连续测定10 次，吸光度均达到0.01以上，称样量1.0 g，加入20 mL提取液，比色时移取体积为0.2 mL，该方法的检出限为0.5 mg/g（0.05%），定量限为3倍检出限1.5 mg/g（0.15%）。

2.4 加标回收与精密度测定

采用叠加法进行加标回收试验，测定回收率和方法的准确性。选取已知含量的核桃样品，分别添加样品本底含量一半的单宁，每个添加浓度做6 个平行，放置2 h后按照本研究优化的样品前处理方式处理测定。由表3 可知，单宁在核桃不同部位中的平均添加回收率在95.6%～112.5%，相对偏差介于2.1%～8.9%之间。从测定结果可知，单宁的加标回收结果较好，满足分析要求。

表3 样品中单宁加标回收试验结果单位：%

2.5 核桃不同样品中单宁含量的测定

对采自云南的4 份核桃样品，剥离出不同的部分，包括青皮、分心木、内种皮和核桃种仁（去掉内种皮），并分别对其单宁含量进行计算，分析结果如表4所示。

3 结论

在核桃主产区，核桃青皮、分心木、核桃内种皮等往往作为核桃仁、核桃乳生产的下脚料废弃处理或作为燃料使用，其药用、商用价值并没有得到很好的开发，同时在废弃、燃烧过程中还污染了环境。核桃各部位及时利用不仅能减少环境污染，也能充分开发其中的单宁活性成分。本文建立了一种快速简便、准确度高的单宁含检测方法，可应用于核桃不同部位单宁含量的分析检测，也有助于快速评价核桃品质。