木蝴蝶苷B 对大鼠肾间质纤维化的作用及机制研究

李佳凌，陈波

（西南医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，四川泸州 646000）

肾间质纤维化是几乎所有类型慢性肾脏疾病的共同病理特征。近5年来，文献报道了多种治疗慢性肾病纤维化的抗纤靶点，其中大麻素受体-1（cannabinoid receptor 1，CB1）被认为具有较高的临床应用价值，是重要的抗纤维化靶点之一（Nastaseet al.，2018；Liu & Zhuang，2019；Prakouraet al.，2019）。Lecru 等（2015）的研究证实在慢性肾病纤维化过程中，CB1 的编码基因Cnr1是10 个最显著上调的基因之一，以CB1 为靶点的抗纤维化治疗能显示出独特的疗效。Prakoura 等（2019）指出抑制CB1 具有抗纤维化作用，这主要与抑制促炎和促纤维化细胞因子分泌、抑制氧化应激和内质网应激、抑制肌成纤维细胞增殖和细胞外基质成分产生有关。CB1 属A 类G 蛋白偶联受体家族，是人脑中表达最高的G蛋白偶联受体，在全身均有表达，以中枢神经系统中的表达水平最高（Yanget al.，2022）。CB1 存在于整个肾脏中，如传入和传出小动脉、肾小球、肾小管、Henle 环和集合管，它也在不同的肾细胞中表达，如足细胞、近端和远端肾小管上皮细胞，以及系膜细胞等（Joseph，2016）。

肾纤维化过程中，肾小管上皮细胞会向间充质表型转化，形成成纤维细胞和肌成纤维细胞，并产生细胞外基质，即上皮-间充质转化（epitheliummesen chymal transition，EMT）。EMT 的特征是上皮标志物的丧失、细胞骨架重组和间充质标志物的获得。上皮细胞标志物E 钙黏蛋白（E-cadherin）对维持上皮细胞的功能发挥了重要作用。肌成纤维细胞标志物α 平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是间充质表型的特征性细胞骨架蛋白，随间充质表型细胞增多而增加。细胞外基质的重要蛋白——纤维连接蛋白（fibronectin，FN）的表达在纤维化早期会显著增加，并随细胞外基质增多而升高。锌指转录因子（Snail）被认为是启动和维持EMT 的重要转录因子之一，Snail 的再表达与纤维化有关，具有促进EMT 的作用。检测上述标记物可以评估EMT（Canoet al.，2000；Boutetet al.，2006；Willis & Borok，2007；Liet al.，2012；Ohnukiet al.，2012；Martiniet al.，2014；Grandeet al.，2015；Lovisaet al.，2015；Simon & Hertig，2015，2017；Chenet al.，2019）。抑制细胞中的CB1 可以减弱蛋白激酶B（Akt）信号（Linet al.，2015），而抑制Akt信号和Snail的表达能抑制纤维化（Zhuet al.，2019）。

目前针对CB1 的中药抗肾纤维化研究尚未见报道。本课题组在实验前期利用药物筛选软件Schrodinger Maestro 11.4 以CB1 为靶点对中药单体进行虚拟筛选，从中药单体数据库中评估了许多靶向CB1（PDB ID：6N4B）的中药单体小分子，其中之一是木蝴蝶苷B（oroxin B，OB）。OB 分子式C27H30O15，分子量594.52 g·mL-1，属于黄酮类单体化合物，存在于常用中药木蝴蝶中，木蝴蝶是紫葳科Bignoniaceae 木蝴蝶Oroxylum indicum的干燥成熟种子，具有广泛的药理作用，如抗氧化、抗微生物、抗炎等，能清肺利咽、疏肝和胃（国家药典委员会，2015；Rojsangaet al.，2017；胡晓茹等，2020；Fenget al.，2021）。本研究旨在探讨OB 通过抑制CB1 抗肾间质纤维化的潜在机制，为OB 的抗肾纤维化研究提供科学依据。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

正常人肾小管上皮（HK-2）细胞购自北京创联生物技术有限公司（编号：BNCC339833）。32 只健康成年雄性大鼠Rattus norvegicus（平均体重235 g±10 g）由西南医科大学实验动物中心提供；动物实验的相关操作均符合实验动物的管理条例，获得西南医科大学动物伦理委员会批准（编号：SWMU20210257）。

OB（MedChemExpress，USA），DMEM/F-12（1∶1）培养基（Gibco/Life Technologies，Grand Island，NY），FBS 胎牛血清（Gibco/Life Technologies，Grand Island，NY），二甲基亚砜（DMSO；Solarbio，北京），重组人转化生长因子-β1（TGF-β1；PeproTech，Rocky Hill NJ，USA），花生四烯基-2-氯乙基酰胺（ACEA；MACKLIN，上海），GAPDH 抗体（1∶30 000；Proteintech，USA），α-SMA 抗体（1∶4 000；Proteintech，USA），Snail 抗 体（1∶1 000；Cell Signaling，USA），Akt 抗 体（1∶1 000；Cell Signaling，USA），Phospho-Akt 抗体（1∶1 000；Cell Signaling，USA），Fibronectin 抗体（1∶1 000；Abcam，UK），E-cadherin抗体（1∶1 000；Abcam，UK），Kim-1 抗体（1∶1 000；SAB，USA），CB1R 抗体（1∶1 000；Abcam，UK），腺嘌呤（Ade；Sigma，USA），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔或小鼠抗体（中杉金桥，北京），HRP化学发光底物（Solarbio，北京），CCK8 试剂盒（DOJINDO，Japan），BCA试剂盒（Thermo，USA），Scr和BUN 测试盒（南京建成生物，南京），HE 染色液和Masson染色液（Solarbio，北京）。

不同浓度的OB 工作液制备：按照OB 说明书先用DMSO 将OB（粉末状）溶解，再依据说明书的配制比例，用培养基将OB 溶解液稀释为所需浓度的工作液。0.75 mmol·L-1浓度的ACEA 工作液制备：按照ACEA 说明书配制比例，用培养基将ACEA 原 液 稀 释 为0.75 mmol·L-1浓 度 的 工 作 液。含10%FBS 的DMEM/F-12（1∶1）培养基配制：将DMEM/F-12（1∶1）培养基与FBS 按照10∶1 的比例进行配制。

1.2 实验仪器

ELX800 型酶标仪（Biotek，USA），PowerPac 型电泳仪和转膜仪（BioRad，USA），6000Exp型化学发光成像仪（CliNX，上海），5910R 型高速冷冻离心机（Eppendodf，Germany），恒温水浴锅（常州市金坛友联仪器研究所），MC0-18AI 型二氧化碳培养箱（Panasonic，Japan）。

1.3 细胞培养

HK-2 细胞用含10%FBS 的DMEM/F-12（1∶1）培养基培养，并放入37 ℃含有5%的CO2培养箱中。细胞培养至对数生长期后备用。

1.4 CCK-8试剂盒检测细胞活力

将HK-2 细胞以5 000 个/孔接种在96 孔板中，分为正常对照组（添加培养基）、浓度梯度组（添加稀释浓度分别为0 µmol·L-1、6.25 µmol·L-1、12.5 µmol·L-1、25 µmol·L-1、50 µmol·L-1、100 µmol·L-1、200 µmol·L-1、400 µmol·L-1的OB 工作液，每组4 个重复孔。根据CCK8 试剂盒说明书检测各组细胞在实验12 h、24 h、48 h时的细胞活力。

1.5 OB 抗TGF-β1 诱导HK-2 细胞纤维化的浓度测定

将HK-2细胞（2×105）接种于6 cm培养皿中，随机分为正常对照组（添加培养基）、TGF-β1组（模型组）、TGF-β1+DMSO 组和TGF-β1+OB 梯度浓度（100 µmol·L-1、50 µmol·L-1、25 µmol·L-1、12.5 µmol·L-1、6.25 µmol·L-1）组。TGF-β1组使用15 ng·mL-1TGF-β1诱导48 h 建立纤维化模型；TGF-β1+DMSO 组使用TGF-β1 组添加1 mL·L-1DMSO 干预24 h；TGF-β1+OB 梯度浓度组使用TGF-β1 组添加浓度分别为100 µmol·L-1、50 µmol·L-1、25 µmol·L-1、12.5 µmol·L-1和6.25 µmol·L-1的OB 工作液干预24 h。根据BCA试剂盒说明书对各组细胞总蛋白浓度进行定量分析。为测定OB 抗TGF-β1 诱导HK-2 细胞纤维化的浓度，Western Blotting 检测各组细胞CB1、α-SMA、FN、E-cadherin蛋白的表达。

1.6 OB 抗TGF-β1 诱导HK-2 细胞纤维化的时间测定和AKT信号、EMT的变化监测

将HK-2细胞（2×105）接种于6 cm培养皿中，随机分为正常对照组（添加培养基）、DMSO组、TGF-β1组（模型组）、TGF-β1+OB 不同时间（12 h、24 h）组。DMSO 组为正常组添加1 mL·L-1DMSO 干预48 h；TGF-β1 组使用15 ng·mL-1TGF-β1 诱导48 h 建立纤维化模型；根据步骤1.5 确认OB 抗HK-2 纤维化的最佳浓度为25 µmol·L-1，故TGF-β1+OB 不同时间（12 h、24 h）组使用TGF-β1组添加25 µmol·L-1OB工作液分别干预12 h 和24 h。根据BCA试剂盒说明书对各组细胞总蛋白浓度进行定量分析。Western Blotting检测各组细胞CB1、α-SMA、FN、E-cadherin、P-Akt、Akt、Snail蛋白的表达，测定OB抗TGF-β1诱导HK-2 细胞纤维化的时间和监测AKT 信号、EMT的变化。

将HK-2细胞（2×105）接种于6 cm培养皿中，随机分为正常对照组（添加培养基）、TGF-β1组（模型组）、TGF-β1+ACEA组和TGF-β1+OB组。TGF-β1组使用15 ng·mL-1TGF-β1 诱导HK-2 细胞48 h 建立纤 维 化 模 型；TGF-β1+ACEA 组先用0.75 mmol·L-1CB1激动剂ACEA 干预1 h，再用TGF-β1诱导48 h；TGF-β1+OB 组使用TGF-β1 组添加25 µmol·L-1OB工作液干预24 h。根据BCA 试剂盒说明书对各组细胞总蛋白浓度进行定量分析。为监测由CB1 引起的AKT 信号改变和EMT 变化，Western Blotting检测各组细胞CB1、P-Akt、Akt、Snail、α-SMA、FN、E-cadherin蛋白的表达。

1.7 腺嘌呤构建大鼠肾间质纤维化模型和OB给药

32 只大鼠饲养于24 °C、50%相对湿度、无特定病原体的环境下，进行12 h 光/暗循环。随机分为正常对照组、Ade 肾病组（模型组）、Ade+低剂量OB 组（Ade+OBL 组）、Ade+高剂量OB 组（Ade+OBH 组），每组8 只。除正常对照组灌胃等量生理盐水，其余3组均以150 mg·kg-1Ade灌胃建立肾间质纤维化模型，每日灌胃1 次，连续25 d。模型建立后，Ade+OBL组和Ade+OBH组分别用5.0 mg·kg-1和20.0 mg·kg-1OB 灌胃。正常对照组和Ade 肾病组灌胃等量生理盐水，每日灌胃1次，连续14 d。

1.8 血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）检测

在灌胃前1 天、灌胃的第25天和灌胃的第39天（即OB 灌胃的第14 天），32只大鼠禁食不禁水12 h，分3 次抽尾静脉血1 mL，按照Scr 和BUN 测试盒说明书检测各组大鼠的Scr和BUN 水平，并监测各组大鼠肾功能的变化。

1.9 组织学分析

第3次血样采集完成后，32只大鼠逐一进行麻醉，每只大鼠均取双侧肾脏制作组织切片，采完肾组织随即处死大鼠。用HE 和Masson 三色对切片（4.5 µm）进行染色，并通过显微镜观察：通过HE染色评估肾损伤，按Tang 等（2021）报告的盲评法进行评分，即根据肾小管坏死、管型形成和肾小管扩张的分级进行损伤评估；通过Masson 染色评估胶原沉积，使用Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，Silver Spring，USA）在每只大鼠的5～10 个等效皮质HPF（200×）中进行胶原沉积量化或胶原沉积面积评分。

1.10 Western Blotting检测大鼠肾组织蛋白

肾脏采集完成后，将32 只大鼠的双肾沿其长轴纵切分为前后2 部分，双肾前部均用于切片制作，双肾后部均用于组织总蛋白提取。组织总蛋白提取后进行低温离心，10 000 r·min-115 min。按照BCA 试剂盒说明书对肾组织总蛋白浓度进行定量。Western Blotting 检测：将蛋白质样本加载到10%SDS-PAGE 凝胶中，再转移到PVDF 膜上。用5%脱脂乳封闭膜后，使用以下抗体：GAPDH 抗体，α-SMA 抗体，Snail 抗体，Akt 抗体，Phospho-Akt 抗体，Fibronectin 抗体，E-cadherin 抗体，CB1R 抗体孵育膜，4 ℃过夜。用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗兔或小鼠抗体孵育膜2 h，再让膜与HRP化学发光底物反应。使用化学发光成像仪显示蛋白条带，并用ImageJ对蛋白条带进行定量分析。

1.11 统计学方法

所有数据用xˉ±SD 表示，每个实验均经过3 次及以上的重复。应用GraphPad Prism 8.0 进行方差齐性分析后进行单因素或双因素方差分析，事后检验采用Turkey 法比较组间差异。P＜0.05 表示组间具有统计学差异。

2 结果

2.1 OB对HK-2细胞增殖的影响

CCK8 结果显示，HK-2 细胞存活率随OB 浓度和时间的增加而降低。OB 浓度≤12.5 µmol·L-1时，12 h、24 h、48 h 组的细胞存活率均在90%以上（P＜0.05）；与正常对照组相比，50 µmol·L-1浓度OB干预细 胞12 h 及以上 或25 µmol·L-1浓度OB 干预细胞48 h，细胞存活率明显降低（P＜0.05）；当OB 浓度＞100 µmol·L-1时，24 h、48 h 的细胞存活率急剧下降（P＜0.05）（图1）。

图1 不同浓度OB处理HK-2细胞后的存活率（n=4）Fig. 1 Survival rate of HK-2 cells after the treatment of OD at different concentrations （n=4）

2.2 OB对TGF-β1诱导HK-2细胞纤维化的影响

2.2.1 不同浓度OB 对HK-2 细胞纤维化的影响与正常对照组相比，模型组（TGF-β1组）中α-SMA、FN 蛋白的表 达显著增加，CB1R、E-cadherin 蛋白的表达显著减少（P＜0.05）。与模型组相比，TGF-β1+OB（6.25 µmol·L-1）组 和TGF-β1+OB（12.5 µmol·L-1）组中CB1R 蛋白的表达显著减少（P＜0.05），但α-SMA、E-cadherin 和FN 蛋白的表达未见显著变化。TGF-β1+OB（≥25 µmol·L-1）组中CB1R蛋白的表达呈梯度下降趋势，其中，TGF-β1+OB（25 µmol·L-1）组的下降趋势最多，且与模型组相比，FN 蛋白的表达显著减少，E-cadherin 蛋白的表达显著增加（P＜0.05）（图2）。

图2 OB对TGF-β1诱导HK-2细胞纤维化中相关蛋白表达的影响（n=3）Fig. 2 Effect of OB on the expression of related proteins in HK-2 cell fibrosis induced by TGF-β1 （n=3）

2.2.2 不同时间的OB（25 µmol·L-1）对HK-2 细胞纤维化的影响与正常对照组和DMSO 组相比，模型组（TGF-β1 组）中CB1R、α-SMA 和FN 蛋白的表达显著增加，E-cadherin 蛋白的表达显著减少（P＜0.05）。与模型组相比，TGF-β1+OB（25 µmol·L-1，12 h）组和TGF-β1+OB（25 µmol·L-1，24 h）组 的CB1R、α-SMA、FN 蛋白表达显著减少，E-cadherin蛋白的表达显著增加，随着时间的延长，CB1R、α-SMA、FN 蛋白的表达进一步减少，而E-cadherin蛋白的表达显著增加（P＜0.05）（图3：B，F，G，H）。

图3 OB对TGF-β1诱导HK-2细胞纤维化中的Akt/Snail信号通路的影响（n=3）Fig. 3 Effect of OB on the Akt/Snail signal pathway in HK-2 cell fibrosis induced by TGF-β1 （n=3）

2.3 OB 对HK-2 细胞CB1/Akt/Snail 信号通路和EMT的影响

与正常对照组和DMSO 组相比，模型组的P-Akt/Akt 显著上升，Snail 蛋白的表达显著增加（P＜0.05）。与模型组相比，TGF-β1+OB（25 µmol·L-1，12 h）组和TGF-β1+OB（25 µmol·L-1，24 h）组的P-Akt/Akt 显著下降，Snail 蛋白的表达显著减少（P＜0.05），且Snail 蛋白的表达随OB 干预时间的增加而减少，且差异显著（P＜0.05）（图3：C，D）。与模型组相比，TGF-β1+ACEA 组中CB1R、α-SMA、FN、Snail 蛋白的表达和P-Akt/Akt 显著增加，E-cadherin 蛋白的表达显著减少（P＜0.05）；而与TGF-β1+ACEA 组相比，TGF-β1+OB 组中CB1R、α-SMA、FN、Snail蛋白的表达和P-Akt/Akt显著减少，E-cadherin蛋白的表达显著增加（P＜0.05）（图4）。

图4 OB对HK-2细胞CB1/Akt/Snail信号通路及EMT的影响（n=3）Fig. 4 Effects of OB on the CB1/Akt/Snail signal pathway and EMT-related proteins （n=3）

2.4 OB 对肾间质纤维化大鼠肾功能和肾脏病理的影响

Ade 诱导的大鼠肾间质纤维化模型建立25 d时，Ade 肾 病 组、Ade+OBL 组、Ade+OBH 组Scr、BUN 浓度较正常对照组均显著升高（P＜0.05）。与Ade 肾 病组 相比，OB 干 预14 d 后，Ade+OBL 组、Ade+OBH 组Scr、BUN 浓度均不同程度降低，且差异显著（P＜0.05）（图5：A，B）。

图5 OB对肾间质纤维化大鼠肾功能和肾脏病理的影响（n=8）Fig. 5 Effect of OB on renal function and renal pathology in rats with renal interstitial fibrosis（n=8）

Ade 肾病组的肾小管上皮细胞明显脱落，部分管腔扩张，炎性细胞浸润间质，胶原成分增加。Ade+OBL组、Ade+OBH 组肾脏病理损伤、胶原沉积较Ade 肾病组均有不同程度的改善，Ade+OBH 组改善程度明显更优（图5：C，D）。

2.5 OB 对大鼠肾组织CB1/Akt/Snail 信号通路和EMT的影响

与正常对照组相比，模型组（Ade 肾病组）中α-SMA、FN、Snail、CB1R 蛋白的表达明显增加，P-Akt/Akt 明显上升，E-cadherin 蛋白的表达显著减少（P＜0.05）。与模型组相比，Ade+OBH 组α-SMA、Snail、CB1R 蛋白的表达显著减少，P-Akt/Akt 显著下降，而E-cadherin 蛋白的表达显著增加（P＜0.05）；Ade+OBL 组仅CB1R 蛋白的表达显著减少（P＜0.05），而Snail、FN、α-SMA、E-cadherin 蛋白的表达和P-Akt/Akt未见变化（图6）。

图6 OB对大鼠肾组织CB1R/Akt/Snail信号通路和EMT的影响（n=8）Fig. 6 Effects of OB on the CB1R/Akt/Snail signal pathway and EMT in rats with renal interstitial fibrosis（n=8）

3 讨论

靶向药物治疗肾间质纤维化是纤维化研究的方向之一。CB1受体被临床视为重要的抗纤靶点，其信号传导能促进氧化应激和炎症、导致细胞凋亡和纤维化（Baruttaet al.，2018）。特别是在肾小管上皮细胞、足细胞和间质肌成纤维细胞中，CB1的药理学阻断或抑制能降低肾纤维化的发生，具有保护肾脏的作用（Lecruet al.，2015；Daoet al.，2019）。

本课题组前期以CB1 为靶点，利用计算机虚拟筛选分子对接，从中药单体数据库中获得了100 个中药单体小分子，并选择目前尚未用于抗纤研究的OB 进行实验。本研究的体外实验结果显示，CB1 激动剂ACEA 对纤维化HK-2 细胞起着积极的促纤作用，ACEA 增加了纤维化HK-2 细胞CB1、Snail、α-SMA、FN 蛋白的表达和P-Akt/Akt，减少了E-cadherin 蛋白的表达（P＜0.05）；而OB 降低了纤维化HK-2 细胞CB1、Snail、α-SMA、FN 蛋白的表达和P-Akt/Akt，增加了E-cadherin 蛋白的表达（P＜0.05）。说明OB 可以通过抑制HK-2 细胞的CB1 蛋白表达，从而抑制Akt/Snail信号传导、EMT，进而抑制TGF-β1 诱导的纤维化。Lin 等（2015）指出通过抑制心肌成纤维细胞的CB1 蛋白表达来减弱Akt信号，抑制心脏纤维化；Zhu等（2019）的研究证实，通过抑制人脐静脉内皮细胞的Akt 信号和Snail 蛋白的表达能抑制内皮-间充质转化和纤维化。这与本研究的体外实验结论基本一致：通过抑制肾小管上皮细胞（HK-2）的CB1 蛋白表达可以抑制Akt 信号和Snail 蛋白的表达，从而抑制EMT，进而抑制纤维化。

本研究体内实验结果显示，高剂量和低剂量的OB 均能改善间质纤维化大鼠的肾功能和肾脏病理情况，并抑制其肾组织中的CB1 蛋白表达；且高剂量的OB 能下调纤维化大鼠肾组织中的Snail和α-SMA 蛋白表达，并上调E-cadherin 蛋白的表达，降低P-Akt/Akt。说明OB 能通过抑制大鼠肾组织中的CB1，抑制Akt/Snail信号传导、抑制EMT，进而抑制大鼠肾间质纤维化。这与本研究的体外实验结论基本一致：OB 能通过抑制肾脏的CB1 抑制Akt 信号和Snail 蛋白的表达，从而抑制EMT，进而抑制纤维化。但OB 抗肾间质纤维化是否还通过其他途径发挥作用，尚需进一步研究阐明。

中药单体OB 能通过抑制肾组织中CB1/Akt/Snail 信号传导，从而抑制EMT，进而抑制大鼠肾间质纤维化。OB的抗肾纤维化能力及机制研究为靶向CB1的OB抗慢性肾病纤维化提供了科学依据。