基于智能手机及机器学习技术对食品中多种抗生素的识别

邓松泉，龚琪，唐艳秋，王楠，陈芳，朱丽华，王靖宇，王宏

华中科技大学化学与化工学院，武汉 430074

分析化学是利用各种手段获得物质化学组成，测量各组成的含量，表征物质的化学结构、形态、能态，并在时空范畴跟踪其变化的各种分析方法及其相关理论的一门科学，是化学中的信息科学。分析化学实验旨在培养学生运用所学理论知识指导实验并通过相关的实验手段获得分析对象组成和量等相关信息的能力。目前分析化学实验主要培养学生熟悉测量原理及掌握相关实验技能。随着环境分析和生化分析等领域的发展，多目标分析物的识别与测定成为分析家们关注的重点。尽管通过分析仪器可获得大量的测试数据，但从大量数据中合理解析有用信息，即“后仪器分析环节”——数据解析则成为多目标物分析的重要环节[1]。而目前高校开设的分析化学实验中很少涉及多目标物分析和大量测试数据的解析，与环境分析等实际分析问题的需求尚有距离。因此培养学生掌握大量数据的解析能力并应用于多目标分析物测定具有重要意义。

比色分析和荧光分析作为一种快速、灵敏、廉价的检测方法广受关注。这两类光学分析方法中光学探针的设计是关键。利用单一探针获取多维信息，发展多目标物质的检测方法有利于提升效率、实现仪器小型化。近年来，智能手机凭借其出色的光学镜头、丰富的色彩分析软件、易于操作和便携性、可提供现场测试和方便共享分析结果等优势日益受到关注。在大量数据解析方面，人工智能中的机器学习方法可指导计算机自动学习输入数据的数据结构和内在规律，有效地从多维数据中提取隐藏信息，实现准确的分类鉴别。在分析化学领域中，机器学习常用于信号和图像处理，通过统计分析对数据进行解析，挖掘隐含信息从而实现对分析对象的分类等功能[2,3]。然而目前分析化学实验很少涉及有关机器学习技术及利用智能手机作为数据获取终端实现多目标物识别的实验。

食品中抗生素残留是食品安全中亟待解决的问题。四环素类抗生素(TCs)对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有广泛的抗菌活性。由于其治疗效果好、成本低、毒性低等优点被广泛用于治疗动物和人类感染[4,5]。此外，四环素类抗生素通常作为促进动物生长的饲料添加剂用于畜牧行业中[6]。抗生素残留超标的食品如猪肉、蜂蜜、牛奶等可能导致严重的副作用，不同的抗生素引起的副作用各不相同。因此检测食品抗生素残留的种类及含量对于食品安全保障具有重要意义。

本实验首先利用配位滴定指示剂铬黑T (EBT)和铕离子(Eu3+)构建了比色荧光双通道探针(EBT/Eu3+)。当在EBT/Eu3+中加入四环素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)及强力霉素(DOX)四种四环素(TCs)后，具有多羰基和羟基结构的TCs作为Eu3+天线效应配体[7]，与Eu3+结合后发射Eu3+特征荧光。同时，TCs可置换EBT/Eu3+配合物中的EBT，引起体系颜色变化。利用智能手机和荧光仪分别获取颜色和荧光双通道信息，借助机器学习中线性判别分析(LDA)，实现了对食品中四种TCs的识别。本实验包含光学探针设计-测试数据获取-测试数据解析的全流程，涵盖了荧光探针设计、智能手机比色、人工智能、分析平台搭建、线性判别分析方法等多个知识点，不仅可培养学生对海量分析量测数据的解析能力，还可以培养学生从单纯的“数据提供者”向“问题解决者”的转变。同时，本实验所涉及的智能手机颜色识别、机器学习技术及食品安全等特色可极大提高学生学习兴趣和积极性。

1 实验部分

1.1 实验原理

1.1.1 EBT/Eu3+探针检测TCs原理

图1描述了铬黑T (EBT)和铕离子(Eu3+)形成的探针(EBT/Eu3+)对四种TCs识别的原理。EBT在pH ＞ 6.3的溶液体系中呈蓝色，与Eu3+结合后变为红色。当加入DOX、CTC、OTC、TC四种TCs后，由于TCs与Eu3+结合能力强于EBT，能夺取EBT/Eu3+中的Eu3+，体系颜色发生变化。由于TCs与Eu3+结合能力随TCs结构不同而异，因而加入不同结构的TCs后体系颜色不同，表现为RGB值差异。由于DOX、CTC、OTC、TC均含有二酮结构，可敏化Eu3+发出Eu3+的特征荧光，但其敏化效果因四种TCs结构而异，表现为EBT/Eu3+加入DOX、CTC、OTC、TC荧光强度不同。基于荧光信号和比色信号与TCs结构的相关性，利用此双通道信号值，借助机器学习中的线性判别分析(LDA)可区分四种TCs。

图1 EBT/Eu3+双通道探针对四种TCs识别的原理

1.1.2 智能手机比色法原理

智能手机比色法是通过手机采集图片，通过APP (Color Grab)直接获取待测物的颜色空间参数，比较颜色色度而获取待测组分浓度的一种分析手段。即首先通过智能手机拍摄颜色图片，再用软件将获得的图片颜色转化为可以数值化的量。本实验通过智能手机采集样品的RGB数据来进行分析[8]。

1.1.3 线性判别分析法的实现

线性判别分析(LDA)是一种监督学习的降维技术，其主要原理为“投影后类内方差最小，类间方差最大”。即将同类型高维数据投影后，将同类型的高维数据聚类到低维空间，使相同类别之间相距较近，而不同类别之间相距较远的一种分析方法[9]。本实验通过应用OriginPro自带的LDA功能进行线性判别分析。

1.2 试剂及材料

四环素(TC)、盐酸土霉素(OTC)、盐酸金霉素(CTC)、盐酸强力霉素(DOX)、三羟甲基氨基固体(Tris)、铬黑T (EBT)、六水合氯化铕(EuCl3·6H2O)、氯化钙溶液(CaCl2)、氯化钾溶液(KCl)、蔗糖溶液(SUC)、青霉素G钠溶液(PG)、链霉素溶液(SM)、α-乳糖溶液(α-L)，以上试剂均为分析纯，盐酸(0.1 mol·L-1)，所用试剂均由国药集团化学试剂有限公司提供。蜂蜜来源于当地超市。

1.3 仪器和表征方法

pH计(雷磁PHS-3C，上海仪电科学仪器股份有限公司)；涡旋振荡器(LAB DANCER S25，IKA)；紫外-可见分光光度计(2700，日本岛津)；荧光光谱仪(RF-5301PC，日本岛津)；荧光分光光度计(FLS50，爱丁堡)；智能手机(带有Color Grab软件)；自制暗箱(带盖的泡沫盒，使用LED稳定光源)。

1.4 实验步骤

1.4.1 实验用溶液的配制

1) 四环素储备液的配制。

称取0.1227 g盐酸四环素(TC)，用蒸馏水溶解、稀释、转移至50 mL容量瓶，配制得50 mL 0.005 mol·L-1的TC标准溶液。同理，分别称取0.1175 g盐酸土霉素(OTC)、0.1315 g 盐酸金霉素(CTC)、0.1343 g 盐酸强力霉素(DOX)，分别配制成50 mL 0.005 mol·L-1的OTC、CTC、DOX标准溶液，待用。

2) pH缓冲溶液的配制。

称取1.2114 g三(羟甲基)氨基甲烷固体(Tris)，用蒸馏水溶解，稀释，通过0.1 mol·L-1的盐酸溶液调节体系的pH为7.0，定容至50 mL，即可得到pH = 7.0的Tris-HCl缓冲溶液(0.2 mol·L-1)。

3) EBT溶液的配制。

称取0.0472 g EBT固体，用蒸馏水溶解、稀释、定容至100.0 mL，得到1.00 mmol·L-1的储备溶液，待用。

4) Eu3+标准溶液的配制。

称取0.1870 g六水合氯化铕固体，用蒸馏水溶解、稀释、转移至50 mL容量瓶定容，得到50 mL 10 mmol·L-1的铕离子标准溶液，待用。

5) 干扰物质溶液配制。

分别称取0.1110 g氯化钙、0.0746 g氯化钾、0.3423 g蔗糖、0.3423 gα-乳糖、0.3564 g青霉素G钠、0.5816 g链霉素，用蒸馏水溶解、稀释、转移至100 mL容量瓶定容，得到100 mL 1 mmol·L-1的标准溶液，待用。

6) 待测样品溶液的配制。

依次分别移取2.00 mL Tris-HCl缓冲溶液、200 μL EBT标准溶液、5 μL Eu3+标准溶液、10 μL TC标准溶液于三支10 mL离心管中，加蒸馏水定容至10.0 mL，得到三份TC/EBT/Eu3+的待测溶液。同理，分别配制OTC/EBT/Eu3+、CTC/EBT/Eu3+、DOX/EBT/Eu3+的标准待测溶液，每种样品溶液平行配制三份。同时，移取2.00 mL Tris-HCl缓冲溶液、200 μL EBT标准溶液，加蒸馏水定容至10.0 mL，得到EBT溶液；移取2.00 mL Tris-HCl缓冲溶液、200 μL EBT标准溶液、5 μL Eu3+标准溶液，加蒸馏水定容至10.0 mL，得到EBT/Eu3+溶液。上述两溶液将用于紫外-可见吸收光谱测试作为对照样品。

依次移取4.00 mL Tris-HCl缓冲溶液、400 μL EBT标准溶液、10 μL Eu3+标准溶液、10 μL TC和10 μL OTC标准溶液于10 mL离心管中，加水定容至10.0 mL，平行三份。同理，分别配制TC/CTC/EBT/Eu3+、TC/DOX/EBT/Eu3+、OTC/CTC/EBT/Eu3+、OTC/DOX/EBT/Eu3+、CTC/DOX/EBT/Eu3+的标准待测溶液。

1.4.2 蜂蜜中TCs的区分及添加TCs的双盲实验

用涡流混合器将2.00 g市售蜂蜜与5.00 mL Tris-HCl溶液混合10 min，以4000 r·min-1离心30 min，取出后得蜂蜜溶液，静置待用。依次移取蜂蜜溶液的上清液20 μL、2.00 mL Tris-HCl缓冲溶液、200 μL EBT标准溶液、5 μL Eu3+标准溶液、10 μL TC标准溶液于10 mL离心管中，加蒸馏水定容至10.0 mL，得到TC/蜂蜜/EBT/Eu3+待测溶液，平行配制三份。同理，分别配制OTC/蜂蜜/EBT/Eu3+、CTC/蜂蜜/EBT/Eu3+、DOX/蜂蜜/EBT/Eu3+的标准待测溶液。同时，依次移取蜂蜜溶液的上清液20 μL，2.00 mL Tris-HCl缓冲溶液，200 μL EBT标准溶液，5 μL Eu3+标准溶液于10 mL离心管中，加蒸馏水定容至10.0 mL，得到BLANK/蜂蜜/EBT/Eu3+待测溶液，即空白组，作为对照

由其他人员将10 μL 0.10 mmol·L-1的TC、OTC、CTC、DOX随机加入到20 μL蜂蜜稀释液中，编号为Unknown 1-4。其他操作与标准样品相同。

1.4.3 重复性实验

对前文所提配制的TCs/EBT/Eu3+的平行标准样进行多次测定计算误差以评价实验的重复性。

1.4.4 选择性实验

依次分别移取2.00 mL Tris-HCl缓冲溶液、200 μL EBT标准溶液、5 μL Eu3+标准溶液至试管中，并分别加入10 μL的氯化钙溶液、氯化钾溶液、青霉素G钠溶液、蔗糖溶液、链霉素溶液、α-乳糖溶液配制6份样品进行后续测定。

1.4.5 紫外-可见吸收光谱测试

以蒸馏水作为参比，对样品进行紫外-可见吸收光谱测试。扫描波长：200-800 nm。

1.4.6 荧光测试

激发波长为400 nm，发射波长为620 nm，激发和发射狭缝都为5 nm。

1.4.7 智能手机比色法测定样品的RGB值

将进行荧光检测后的样品放入具有稳定光源的自制暗盒中，将智能手机固定在暗盒上。对同一样品拍照三次，利用Color Grab软件采集样品的RGB值。

1.4.8 数据处理及LDA的实现

将所获得的各样品的RGB值及荧光强度值求平均值和标准偏差后导入OriginPro 2016，采用LDA线性分析得到区分图。

2 结果与讨论

2.1 EBT/Eu3+探针加入TCs后颜色及荧光变化

图2a是不同样品的吸收光谱。EBT作为一种金属离子指示剂，在pH ＞ 6.3的溶液体系中呈蓝色，在624 nm处有吸收峰(绿色曲线)，与Eu3+结合后形成配合物，吸收峰移动到533 nm (蓝色曲线)，溶液呈红色。TCs含有多羰基结构，能与金属离子在不同条件下能形成1 : 1、1 : 2或2 : 1型配合物[10]。当EBT/Eu3+中加入TCs后，TCs夺取EBT/Eu3+配合物中Eu3+，533 nm处的吸收峰降低，624 nm处的吸收峰上升，伴随着溶液的颜色由红色又变成紫色。由于四种TCs与Eu3+结合能力不同导致四种溶液的A626nm/A533nm不同，表现出不同颜色，采用智能手机拍照后获得的RGB值不同。

图2b是不同样品的荧光光谱。具有二酮类结构的TCs与Eu3+配位后，可将吸收的光传递给稀土离子，敏化稀土离子发光。由图2b可知，在EBT/Eu3+体系中加入四种TCs后，EBT/Eu3+/TC和EBT/Eu3+/OTC体系在620 nm均发射出很强的Eu3+特征荧光。而EBT/Eu3+/CTC和EBT/Eu3+/DOX体系中620 nm的荧光峰很弱，这可能是CTC和DOX与Eu3+能量传递效率不高所致，不同结构的TCs引起体系荧光差异为TCs的识别提供了基础。

2.2 EBT/Eu3+探针对一元TCs的识别

TCs加入EBT/Eu3+溶液后，体系的比色和荧光响应信号随TCs结构而异，表明EBT/Eu3+对抗生素选择性识别具有可行性。为了获得最佳的识别效果。对体系条件进行了优化以获得最佳的比色信号与荧光信号。研究发现当体系的激发波长为400 nm，pH为7.0，铕离子浓度为5 μmol·L-1，EBT浓度为20 μmol·L-1，反应时间为8 min时，可以获得最佳的比色信号和荧光信号，同时有利于体系应用于蜂蜜等实际样品的检测[11]。

在所获得的最佳条件下，采用智能手机和荧光光度计对四种TCs加入EBT/Eu3+后进行拍照和荧光测试获得不同体系的荧光强度和RGB值，所得结果如图3a所示。当加入的TCs浓度为5.0 μmol·L-1时，四种溶液的RGB值和荧光强度呈现明显的差异，这是由于四种四环素与Eu3+结合能力和敏化效果不同所致。LDA作为一种分类识别方法已成为区分类似分析物的重要手段[12]。利用TCs加入EBT/Eu3+溶液后比色和荧光双通道信号，借助LDA可以区分不同结构的四环素，采用OriginPro软件处理数据(4种信号值 × 3个平行样 × 4组样)，得到LDA图，结果如图3b所示。LDA通过对带标签的点进行投影，建立不同样品间分类差异，以保证组内距离最小而组间距离最大，使原始的多维数据处理为易区分与识别的二维数据。根据LDA特点可知，组间距离越远则差异越大，图3b中每个点代表每种TCs对EBT/Eu3+的响应，12个原始数据点明显被分成4组，分别为TC、OTC、CTC和DOX，且每组的距离很远，同一组内各点距离很近，表明TC、OTC、CTC和DOX能被有效区分。

图3 (a) EBT/Eu3+溶液中四种TC的比色和荧光响应；(b) EBT/Eu3+传感器阵列区分四种TCs的二维LDA图

2.3 EBT/Eu3+探针对二元TCs的识别

为了探究EBT/Eu3能否识别两种TCs混合物，从所实验的四种TCs中任意选择两种进行1 : 1混合后获得总浓度为10 μmol·L-1的二元混合物。将混合体系进行荧光测试和智能手机拍照获取荧光强度和RGB值，结果见图4a。由图4a可知，六种混合体系的荧光强度和RGB值各不相同。图4b是LDA结果，由图可知，六种二元混合物距离较远，没有任何重叠，表明所有样本中两种抗生素可以完全分离，EBT/Eu3+双通道探针具有分析复杂样品的潜在能力。

图4 (a) EBT/Eu3+溶液中二元标准样品的比色和荧光响应；(b) 利用Eu3+/EBT区分不同的两种TCs的混合物LDA图

2.4 EBT/Eu3+探针区分蜂蜜样品中TCs

为了评价EBT/Eu3+识别TCs在实际样品中的应用，将四种浓度均为5.0 μmol·L-1的TCs加入到蜂蜜样品中。按照前述方法进行比色与荧光测试，再进行LDA处理，所得结果如图5。图5a为蜂蜜样品中加入不同TCs的荧光强度和RGB值，四组样品和空白样具有不同的荧光强度与RGB值。由图5b可知四种TCs在蜂蜜样品中也能被明显分为4组，且4组样品与空白样品距离很远。表明此方法在实际样品中具有区分TCs的能力。

图5 (a) 含EBT/Eu3+的蜂蜜样品中加入不同TCs后的比色和荧光响应；(b) 利用Eu3+/EBT区分蜂蜜样品中TCs的LDA图

此外，为了验证该方法识别未知样品的可靠性，还根据上述训练矩阵检测4种未知的样本。将4种浓度均为5.0 μmol·L-1的TCs由他人加入到蜂蜜样品中制备成盲样(Unknown 1-4)，采用上述同样的方法进行了识别。由图6可知，四个盲样可以准确分类到相应的标准样品类别，获得100%识别准确度。这一结果表明所设计的双通道传感器阵列能够识别未知的TCs样品。

图6 利用Eu3+/EBT区分蜂蜜中TCs盲样的LDA图

2.5 实验的重复性

图7展示了EBT/Eu3+双通道传感阵列对TCs分析的重复性结果，对样品荧光以及RGB值均进行了三组平行测定。图7a显示了三次平行测定荧光强度所得的结果，由此可以看出实验的重复性良好，图7b显示的RGB值平行测定的结果类似。由此可知，实验的重复性良好。

图7 EBT/Eu3+探针加入TCs后荧光强度(a)及RGB值(b)重复测试的结果

2.6 选择性实验

图8展示了EBT/Eu3+双通道传感阵列对TCs选择性识别的结果。选择了6种可能干扰识别TCs的物质，包括Ca2+、K+、链霉素(SM)、青霉素G钠(PG)、α-乳糖(α-L)、蔗糖(SUC)用于评价对TCs识别的影响。由图8可知，除了TCs展示出高响应性外，这些干扰物质均无荧光发射(图8a)。颜色系统值的响应也与TCs组别相去甚远(图8b)。图8c是采用LDA方法处理后得到二维计分图。四种TCs和干扰物明显被区分为五个区域，且相互分离。这些结果表明，这些物质对EBT/Eu3+识别TCs没有影响，即EBT/Eu3+双通道阵列对检测TCs具有良好的选择性。

图8 EBT/Eu3+双通道传感阵列对于TCs以及所选干扰物质的荧光强度(a)、比色响应(b)，以及LDA对该数据进行识别的结果(c)

3 结语

本文发展的方法不仅能够成功实现四种一元四环素的定性识别，还能有效识别二元四环素混合物及蜂蜜中未知TCs样品的识别，正确率达100%。本实验涵盖了分析化学与人工智能等多学科，有利于培养学生的综合能力。利用指示剂与稀土离子制备双通道探针以获得不同信号，构思巧妙。使用普及率高的智能手机、荧光仪器和OriginPro软件中的模式识别技术，推广性好。同时本实验的原料廉价易得，操作简单，环境友好，重复性好，每人每次成本约为3.8元，教学时长约8-10 h，非常适合于本科生高年级的分析化学综合实验。