气相色谱法测定清肠栓中樟脑残留量和冰片含量

2023-10-07潘宇炯何志高章恒周杨月红黄景山上海中医药大学附属龙华医院上海0003上海万仕诚药业有限公司上海0507

药学实践杂志 2023年9期

潘宇炯，何志高，周昕，章恒周，杨月红，黄景山（.上海中医药大学附属龙华医院, 上海 0003；.上海万仕诚药业有限公司, 上海0507）

清肠栓是由上海市名中医马贵同教授创制的医院制剂。该方基于溃疡性结肠炎“湿热瘀互结肠道”的关键病机，以清热化湿、活血止血立法，在锡类散、青黛散治疗黏膜溃疡的基础上优化筛选而来[1-2]。主要由三七和青黛全粉入药，五倍子和马齿苋经提取后浸膏粉入药，再加入冰片、羊毛脂，以半合成脂肪酸酯为基质制备而成的中药栓剂。

冰片为一种传统中药，清香宣散，具有开窍醒神，清热败毒的功效。现代药理学研究表明，冰片具有镇静安神、醒脑、促透、抗菌、抗炎等作用[3]。冰片常被用于肛肠外科，可避免药物的首过效应，提高药物有效性。冰片能开放并透过血脑屏障，有助于其他药物通过血脑屏障，促进疗效[4]。

冰片具有挥发性，龙脑常被作为其主要的质量控制指标，含量测定方法主要包括气相色谱法、衍生化高效液相色谱法、薄层色谱法等[5]。2020 年版《中国药典》中，采用气相色谱法测定，冰片含龙脑成分不得少于55.0%，樟脑不得超过0.50%[6]。目前，已有文献对清肠栓中三七皂苷、人参皂苷、没食子酸、靛蓝和靛玉红进行含量测定[7-8]，故本实验采用气相色谱法对清肠栓中冰片含量进行测定，并计算龙脑、异龙脑的相对含量，为进一步提高清肠栓的质量控制提供有效依据。

1 材料

1.1 仪器

7820A 型气相色谱仪、氢火焰离子化检测（FID）（美Agilent 公司）；225D-1CN 型电子分析天平、BSA124S 型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司，精度：十万分之一）；S450H 型超声波清洗器（德国Elma）。

1.2 试药

清肠栓为院内制剂室提供（批号：210420-210425、211018、211020、211022、211025、190107、190114、190121、190304、190311、190318、190408、190415、190422、190506、190513 和200302）；樟脑对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：2814，纯度：95.0%）；龙脑对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110881-201709，纯度：99.6%）；异龙脑对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111512-201904，纯度：98.4%）；水为超纯水（实验室自制）；乙酸乙酯（上海凌峰化学试剂有限公司，分析纯）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent7890A 型气相色谱仪FID 检测器；DIKMA DM-Wax 聚乙二醇20 000（PEG-20M）毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；进样口温度为250 ℃；检测器（FID）温度为250 ℃；柱温140 ℃；空气流速为450 ml/min，氢气燃气流速为50 ml/min；尾吹气为25 ml/min；分流比为20:1，进样量为1 µl。理论板数按龙脑峰计算应不低于2 000。

2.2 对照品溶液的制备

称取樟脑对照品适量，精密称定，加乙酸乙酯溶解，制成每1 ml 含樟脑0.1 mg 的对照品溶液。另取龙脑、异龙脑对照品适量，精密称定，加乙酸乙酯溶解，制成每1 ml 含龙脑0.3 mg、异龙脑0.2 mg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取清肠栓（批号：200 302）样品10 粒，研细，取约60 mg，精密称定，置10 ml 量瓶中，加乙酸乙酯8 ml，超声（频率37 kHz，功率800 w）处理30 min，放冷，加乙酸乙酯至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

按清肠栓制剂处方比例，配制缺冰片的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性试验

精密吸取樟脑对照品溶液、龙脑和异龙脑对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各1 µl，按“2.1”项色谱条件下方法分别进样测定，结果樟脑、异龙脑和龙脑对照品的理论板数分别为88 684、107 331、108 387，远大于规定的2 000。供试品溶液色谱图中，未检出与樟脑对照品溶液保留时间相同的色谱峰，阴性对照溶液色谱图中在与龙脑、异龙脑相同保留时间处无干扰峰，表明该方法专属性良好。色谱图见图1。

图1 樟脑对照品(A)、龙脑和异龙脑对照品(B)、阴性对照(C)和供试品溶液(D)

2.5.2 线性关系

分别精密称取龙脑对照品14.92 mg、异龙脑对照品10.25 mg、樟脑对照品4.83 mg，置同一10 ml量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 ml 含龙脑1.492 mg、异龙脑1.025 mg、樟脑0.483 mg 的混合对照品溶液，作为贮备液。

精密吸取5 份贮备液各1 ml，加乙酸乙酯分别稀释50 倍、20 倍、5 倍、2 倍、1 倍；分别精密吸取5 个不同浓度的龙脑、异龙脑、樟脑混合对照品溶液，分别进样1 µl，按按“2.1 色谱条件”项下的方法测定，以进样浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程分别为：Y1=283.4X1+1.320（r=1.000，n=5）；Y2=283.5X2+0.859 7（r=1.000，n=5）；Y3=276.9X3+0.544 4（r=1.000，n=5）。线性范围分别为 0.0299～1.497µg、 0.0205～1.025µg、0.0097～0.4830µg。

2.5.3 精密度试验

精密吸取“2.2”项下对照品溶液，按“2.1 ”项的方法测定，重复进样6 次，测定峰面积。结果龙脑、异龙脑、樟脑峰面积RSD 分别为0.3%、0.4%、0.6%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液（批号：200 302），室温下分别放置0、4、8、12、16、20、24 h，按“2.1 色谱条件”项下的方法测定，记录峰面积。结果樟脑未检出，龙脑与异龙脑峰面积的RSD 分别为1.6%和1.5%，表明供试品溶液在室温下放置24h 稳定。

2.5.5 重复性试验

精密称取清肠栓样品粉末60 mg（批号：200302），精密称定，平行称取6 份，按“2.3 供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，按“2.1”项方法测定，结果均未检出樟脑，龙脑和异龙脑平均含量的RSD分别为0.8%和1.1%（n=6），表明该方法的重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验

称取清肠栓样品粉末30 mg（批号：200302），精密称定，平行称取6 份，分别精密加入龙脑、异龙脑、樟脑对照品溶液，按“2.3” 项方法制备供试品溶液，按“2.1”项方法测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 龙脑回收率试验(n=6)

2.6 样品含量测定

取清肠栓制剂2019、2021 年共20 个批次的样品，按“2.3”项方法制备供试品溶液，再按“2.1”项方法测定，20 个批次均未检出樟脑。样品中龙脑和异龙脑含量见表2（表中1～10 为2019 年样品，11～20 为2021 年样品）。

表2 清肠栓样品含量实验

3 讨论

3.1 提取方式的考察

乙酸乙酯对冰片具有较好的溶解性，并且样品中其他干扰成分的溶出较少，故选择其作为提取溶剂。本实验考察了不同提取时间（15 min、30 min、45 min）对样品提取效果的影响，观察比较不同条件处理后供试品溶液色谱情况，根据含量结果选择提取时间为30 min。最终以乙酸乙酯为提取溶剂，超声处理30 min 作为供试品制备时的提取方式。

3.2 色谱条件的选择

柱温的选择：由于2020 年版《中国药典》中冰片含量测定选择的注温为140 ℃，而查阅文献，部分实验者选择的柱温为160 ℃[9]，因此，我们分别选择140 ℃和160 ℃进行试验，根据出峰时间及峰形比较，最终选择140 ℃作为实验条件。色谱柱的选择：实验研究使用的两种色谱柱分别为DIKMA DM-Wax（PEG-20M）毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；Agilent HP-INNOWAX（PEG-20M）毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm），比较两种色谱柱的塔板数，实验显示色谱峰分离度良好，说明色谱柱对样品的测定结果影响较小，此方法具有普遍性，故最终选择本实验室常用的DIKMA DM-Wax 色谱柱。樟脑检出限和定量限确定：检测限及定量限采用信噪比法确认，当信噪比（S/N）为3∶1 时，樟脑检出限为1.4 μg/g；当信噪比（S/N）为10∶1 时，其定量限为4.6 μg/g。