河豚毒素处方前初步研究

徐己人，郑紫云，李 园，鲁 莹，储智勇, （.上海海洋大学, 上海 006；.江苏中洋集团股份有限公司, 江苏 海安 6600；.海军军医大学药学系, 上海 004）

河豚毒素（TTX）属于氨基全氢化喹唑啉化合物，分子式为C11H17O8N3，分子量为319。其分子结构类似于生物碱[1]，呈独特的笼形，如图1。河豚毒素粗品为黄褐色粉末，纯品为白色晶体，呈弱碱性，容易潮解，微溶于水溶液，易溶于无机酸水溶液，且在弱酸条件下稳定；对于热不敏感，但在高温下毒性会增强，强酸强碱条件下其结构可被破坏[2]。

图1 河豚毒素结构式

河豚毒素是一种高效的神经类毒素，由于能够特异性的阻断Na+离子通道，进而产生麻痹作用，因此低浓度的河豚毒素被认为是一种优良的神经类候选药物，一直受到科研人员尤其是新药研发人员的关注[3]。目前已有将河豚毒素作为止痛药[4-5]和成瘾戒断药[6]的相关探索和研究。由于河豚毒素在药学领域有着广阔前景，关于其药学应用的研究报道逐年增多，但大多集中在分析方法[7]、药理机制[8]或药物载体研究[9]，对其可成药性的相关研究报道较少。本文按照新药研发要求，建立高效液相反相离子对色谱法，对河豚毒素在不同溶剂中的溶解性和不同pH 环境中的稳定性进行考察，为河豚毒素的处方前研究积累数据，为其进一步临床应用提供有力支撑。

1 材料

1.1 仪器

LC-2030C 高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；AL-104 电子天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；数显pH 计（sartorius，德国）；紫外可见分光光度计（安捷伦科技（中国）有限公司）；循环水式真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；SECURA125-1CN 型十万分之一电子天平（赛多利斯，德国）；Arium@ mini 超纯水机（赛多利斯，德国）。

1.2 试药

河豚毒素原料药（中洋生物科技江苏有限公司，批号：20220089，含量88%）；河豚毒素对照品（泰州康特生物工程有限公司，批号：201206，含量≥99%）；磷酸、98%甲酸、柠檬酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠、庚烷磺酸钠、磷酸二氢铵、乙酸铵、盐酸、30%H2O2和冰醋酸均为分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Shim-pack GISI C18-AQ（4.6×250 mm，5 μm）；流动相为5 mmol/L 庚烷磺酸钠-25 mmol/L磷酸二氢铵，等度洗脱；进样量为10 μl；柱温：25 ℃；流速1 ml/min；检测波长为196 nm；检测时长为40 min。

2.2 对照品储备液的制备

取TTX 对照品适量，精密称定，用0.1%磷酸溶液溶解并稀释制成浓度为1.0 mg/ml 的TTX 对照品储备液。

2.3 供试品储备液的制备

取TTX 原料药适量，精密称定，用0.1%磷酸溶液溶解并稀释制成浓度为1.0 mg/ml 的供试品储备液。

2.4 溶解度试验测试溶液的制备

按照《中国药典》（2020 版）四部通则8 004 缓冲液配制方法，配制pH 值分别为3.5、4.5、5.0、6.5、7.0、7.4、8.0 的缓冲液[10]。称取研成细粉的TTX 原料药各2 mg，分别置于4 ml 不同pH 值的缓冲液（25±2 ℃）中，30 min 内每隔5 min 强力振摇30 s，观察溶解情况，如无目视可见颗粒，视为完全溶解。如完全溶解则继续加入研成细粉的TTX 原料药，同法操作直至饱和，取适量经滤膜滤过，作为溶解度试验测试溶液。

2.5 强酸与强碱破坏试验测试溶液的制备

取研成细粉的TTX 原料药约1 mg，置于10 ml容量瓶中，分别用0.1 mol/L 盐酸和0.1 mol/L 氢氧化钠溶液溶解并定容，置于70 ℃下反应20 min。精密量取各反应溶液适量，冷却至室温，分别加入对应体积的0.1 mol/L 氢氧化钠或0.1 mol/L 盐酸进行中和并终止反应。取适量样品经滤膜过滤后作为强酸与强碱破坏试验测试溶液。

2.6 氧化破坏试验测试溶液的制备

取研成细粉的TTX 原料药约1 mg，置于10 ml容量瓶中，加入30% H2O2溶液溶解定容后，室温反应10 min。精密量取反应溶液适量，经滤膜过滤，作为氧化破坏试验测试溶液。

2.7 稳定性试验测试溶液的制备

取研成细粉的TTX 各适量，精密称定，分别用PBS 缓冲液（pH 值=7.4）、0.1%甲酸溶液、0.1%柠檬酸溶液溶解，并稀释制成浓度为0.1 mg/ml 的TTX 溶液，然后分别置于4 ℃、25 ℃、37 ℃中储存，在第1、2、3、5、7、14、21、28 d 各取适量经滤膜过滤，作为温度适应性测试溶液。

3 结果

3.1 方法学验证结果

3.1.1 系统适用性

分别将对照品储备液及供试品储备液用0.1%磷酸溶液稀释至0.1 mg/ml，作为对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项进行测试。如图2 所示，TTX 的保留时间为22.665 min。理论板数为14 501，供试品溶液中主峰与邻峰的分离度为6.4。结果表明，此色谱条件可以满足TTX 相关测试要求。

图2 TTX 对照溶液(A)与供试品溶液(B)的典型色谱图

3.1.2 标准曲线

取对照品储备液，用0.1%磷酸溶液配制浓度为4、10、20、40、80 μg/ml 的TTX 对照品测试溶液，按“2.1”项进行测试。以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=12 601.2X-2 263.69（r=0.999 9）。结果表明，TTX的浓度与峰面积在测试范围内呈良好线性关系。

3.1.3 准确度与精密度

取对照品储备液，用0.1%磷酸溶液分别稀释至10、20、40 μg/ml 的溶液各3 份，按“2.1”项进行测试，计算其含量的平均值为101.000%，RSD 为0.60%，表明该方法准确度良好，满足测试要求。

3.1.4 进样重复性及稳定性

取供试品溶液，按“2.1”项重复测试6 次，计算得到的RSD 为0.17%，表明该方法重复性良好。室温分别放置0、2、4、6、8、10、12、24、48 h 后按“2.1”进行测试。计算得到的RSD 为1.48%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

3.2 溶解度及稳定性考察结果

3.2.1 溶解度考察结果

由表1 结果可看出，TTX 几乎不溶于碱性水溶液，但溶解度随着pH 值降低而逐渐增大，易溶于pH 值为3.5 的酸性水溶液。

表1 TTX 在不同pH 值水溶液中的溶解度

3.2.2 破坏试验结果

实验结果表明，强碱对TTX 的破坏能力最强，在0.1mol/L 氢氧化钠溶液中、70 ℃条件下反应20 min 后，TTX 被完全降解。强酸对TTX 的破坏能力次之，TTX 在70 ℃、0.1mol/L HCl 溶液中反应20 min 后的降解率为60.78%；氧化对TTX 的破坏能力相对最弱，在30% H2O2溶液中反应20 min后的降解率为17.06%。

3.2.3 稳定性考察结果

不同介质、不同温度条件下TTX 稳定性试验结果见图3。当溶剂为pH 值=7.4 的PBS 溶液时，不同温度下TTX 均表现出降解趋势，在25 ℃与37 ℃条件下保存28 d 的TTX 溶液降解率均超过50%，在37 ℃时PBS 溶液中的TTX 降解率更高达88.07±0.27%，提示在后续剂型研究中，需注意TTX 在体外释放液中的稳定性。以0.1%甲酸溶液或0.1%柠檬酸溶液为溶剂的TTX 溶液则较为稳定，在25 ℃和37 ℃下保存28 d 含量均未表现出显著性变化。

图3 TTX 在不同温度、不同介质中的稳定性(A.4 ℃条件下TTX 浓度变化趋势；B.25 ℃条件下TTX 浓度变化趋势；C.37 ℃条件下TTX 浓度变化趋势)

4 讨论

TTX 作为一种具有广泛应用前景的潜在镇痛药物，其在药理和作用机制方面的相关研究已有较多报道[11-13]，但对于其理化性质和成药性研究的报道极少。本研究建立了高效液相反相离子对色谱法，测定TTX 在不同溶剂中的溶解性，并考察温度、溶剂pH 值和氧化剂对其稳定性的影响。实验结果表明TTX 在酸性条件下具有较高的溶解度，前期试验还表明TTX 不溶于乙醇，二氯甲烷等有机溶剂。稳定性试验结果显示TTX 在强碱溶液中较不稳定，实验条件下20 min 即被强碱全部降解，而在酸性条件、氧化环境中较为稳定。不同温度稳定性试验结果同样显示，TTX 在0.1%甲酸或柠檬酸溶液中4 周内稳定性均良好；而在pH 值=7.4 PBS 中降解较为迅速，即使在4 ℃条件下，pH 值=7.4 PBS 中28 d 的降解率仍然接近50%，37 ℃条件下28 d 降解率接近90%。研究结果可为TTX处方设计及制备工艺提供实验依据，并提示研究者在开展TTX剂型研究和体外释放研究时应重点关注其稳定性和降解情况。