雷帕霉素抑制异动症大鼠模型纹状体神经元电活动

许叶 周畅 李建红 赵振强 王埮 陈志斌

(1海南医学院,海南 海口 570102;2海南医学院第一附属医院神经内科;3海南医学院第二附属医院)

帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病,其主要的病理解剖特点为中脑黑质致密部(SNc)多巴胺能神经元进行性大量死亡,投射到纹状体的多巴胺能神经纤维减少而致纹状体多巴胺含量显著下降,从而出现一系列运动症状和非运动症状,严重影响患者的正常工作和日常生活。 到目前为止,左旋多巴(L-DOPA)仍然是治疗PD最有效的药物。然而在L-DOPA治疗5年后,80%以上PD患者出现疗效减退,并且发生难以控制的运动并发症——L-DOPA诱发异动症(LID)〔1,2〕。LID一旦出现就会长期保持,不仅阻碍了L-DOPA对PD的进一步治疗,而且患者为了改善症状需要接受侵入性和风险程度更高的治疗,如深部脑电刺激术等。因此阐明LID的发病机制,并寻找有效的干预措施对于PD的治疗至关重要。研究表明纹状体区神经元异常放电是导致患者出现LID的重要原因之一。在LID模型中直接通路中间多棘神经元(MSNs)内的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路被持续激活;阻断mTOR的信号转导能明显减轻LID而不影响L-DOPA对PD的治疗作用〔3～5〕,提示mTOR信号的激活可能是导致LID纹状体神经元异常发电的机制之一,并可能成为治疗LID的新靶标。因此,本文对雷帕霉素抑制LID大鼠模型纹状体神经元电活动展开研究。

1 材料和方法

1.1实验动物 SPF级Sprague-Daewley大鼠,雄性,体质量(200±20)g,开熄灯各12 h,温度控制在20～25 ℃,湿度控制在40%～60%,自由进食进水,试验前先适应性训练3～4 d。饲养过程严格按照华中科技大学同济医学院实验动物中心管理条例执行。

1.2试剂和设备 6-羟多巴(OHDA)、左旋多巴甲酯、盐酸苄丝肼、雷帕霉素、二甲基亚砜(DMSO)、维生素C粉剂(美国sigma公司),阿扑吗啡(美国Cayman公司),红霉素软膏(马应龙药业集团有限公司),Tween-20(Beyotime公司),聚乙二醇400散剂(汕头市迅能贸易有限公司)。桌面数显脑立体定位仪、微型手持式颅钻、通用夹持器(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);多通道电路板、多通道电极基座、镍铬合金丝、金属焊接丝、数据采集处理器、USB Data Cables、16通道输入输出端口扩充组件及线缆、电极连接适配器(江苏易格生物科技公司);AB胶(得力集团有限公司);NeuroStudio 128通道、解旋器转接套装、Headstage(Bio-Signal Technologies);DELL 双屏台式电脑(戴尔股份有限公司);Offline Store软件;NeuroExplorer软件。

1.3实验分组及模型制备 本实验采用序贯的模式进行实验分组。首先所有大鼠参照参考文献〔6〕使用6-0HDA脑立体定位微量注射制成PD模型。以7%水合氯醛麻醉。麻醉后给予6-0HDA(2 μg/μl)(钻颅坐标:AP:4.2;ML:1.5 mm;DV:-7.8 mm)注入一侧SNc。在明确PD造模成功后进一步连续21 d腹腔注射L-DOPA+苄丝肼制作LID模型。随后所有LID模型大鼠随机分成2组,其中实验组连续腹腔注射L-DOPA+雷帕霉素21 d, 1次/d;对照模型(假手术组):在LID模型基础上,连续腹腔注射L-DOPA+DMSO 共21 d,1次/d。所有建模成功大鼠在7%水合氯醛0.5 ml/100 g腹腔麻醉下通过脑立体定位仪植入多通道电极阵列。观察到的信号是电极尖端所在位置的平均胞外场电位(mEFP)〔7〕。

1.4行为学实验及LID评分 术后第14天,头颈部皮下注射阿扑吗啡(0.05 mg/kg)诱导大鼠向对侧旋转,5 min后开始观察,每5 min记录一次,持续记录30 min。记录结果平均>7 r/min或>210 r/30 min为达标PD模型。各组均进行异常不自主运动(AIM)评分〔8〕。雷帕霉素组和对照组给药后20 min进行评定,20 min/次,共6次,计算120 min内总分数。理想状态下用药后每个评分时间点满分为16分,累计总分为96分。

1.5脑立体定位法多通道电极植入 实验中采用自制16通道电极,参照参考文献〔9〕进行制作。电极丝为0.001 3英尺镍铬合金丝,排列固定在电路板上,参考电极丝与其余电极丝之间间隔500 μm,其余电极丝间距为350～400 μm。电路板固定在电极基座上。制作完电极后进行手术埋置多通道电极阵列。Sprague-Daewley大鼠以7%水合氯醛0.5 ml/100 g行腹腔麻醉,固定于脑立体定位仪上,常规头颅手术消毒备皮后,以前囟为原点确定坐标,前后囟相差不超过2 mm,按照Paxinos&Watson大鼠解剖图谱以右侧纹状体为靶区,手持颅钻在对应的坐标上钻孔(钻颅坐标:AP:-1.5 mm;ML:0.1 mm;DV:-3.8 mm)。去除骨瓣及硬脑膜后将电极缓慢下放至大鼠纹状体区。手术结束后大鼠放回笼中休养恢复1 w后再进行下一步实验。

1.6纹状体神经元放电活动的记录、整理和分析 连接headstage与大鼠头部的电极排母,调试Neurostudio多通道数据采集系统,设置滤波参数和阈值线:低频场电位为200 Hz以下,采样频率为2 ks/s;高频动作电位为300 Hz以上;阈值线为-65 mV。设置完后对数据进行保存记录。记录完毕后,数据输入OfflineSorter软件,分离提取锋电位和局部场电位(LFPs),Neuroexplorer分析导出LFPs,Matlab功率谱密度和时频分析。

1.7电生理 本实验中纹状体成功植入多通道电极大鼠共10只,其中假手术组4只,记录30个神经元;实验组6只,PD状态采集神经元72个,LID状态神经元45个。雷帕霉素干预1 w后神经元39个,雷帕霉素干预2 w后神经元78个。植入电极成功的大鼠分成假手术组和实验组。实验组根据大鼠所处实验状态不同分为PD组、LID组、雷帕霉素1 w组、雷帕霉素2 w组,用以观察PD、LID大鼠纹状体神经元的放电情况及雷帕霉素使用时间长短对于纹状体神经元异常放电的影响。

1.8电极位点损毁及鉴定 实验结束后予7%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,连接电流器,对电极排母孔逐一通电损毁,将电极损毁后的大鼠固定在解剖台上先后使用生理盐水100～150 ml及200 ml 4%多聚甲醛进行心脏灌注。停止灌流后,断头取全脑,4%多聚甲醛浸泡2 h,30%的蔗糖4 ℃过夜,待组织沉降后进行纹状体冰冻切片观察。电极所在位点见图1。

图1 电极位点损毁及鉴定

1.9统计学分析 釆用SPSS22.0软件进行分析。满足正态分布和方差齐性的数据不同组比较采用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA),不满足正态分布和方差齐性的数据采用非参数检验。提取的电生理信号通过OfflineSorter、Neuroexplorer软件分析导出数据。用GraphPadPrism8软件制图。

2 结 果

2.1雷帕霉素改善L-DOPA诱导LID大鼠的不自主运动 L-DOPA可以诱发大鼠出现不自主运动,随着用药天数逐渐延长,大鼠可表现出偏侧扭转等不自主运动。自用药第9天起,雷帕霉素组AIM评分较对照组明显下降(P<0.05)。见表1。

表1 两组不同天数AIM 评分分)

2.2雷帕霉素显著抑制LID大鼠纹状体神经元放电频率 LID组纹状体神经元的放电频率明显高于假手术组(P<0.001),经过雷帕霉素干预1 w后纹状体神经元放电频率明显较LID组下降(P<0.001),干预2 w后纹状体神经元放电频率较干预1 w时略有升高,但两者无明显统计学差异(P>0.05)。见图2、表2。

表2 各组纹状体神经元及簇状放电频率比较

图2 各组纹状体神经元放电频率对比

2.3雷帕霉素改善LID局部场电位变化 局部场电位原始波形图时频见图3。在10 Hz以下的低频段及10～20 Hz之间的中频段,PD组色彩最淡,LID组能量明显高于PD组,经雷帕霉素干预1 w和2 w后能量较LID组明显降低,低频组能量经雷帕霉素干预1 w和2 w无显著性差异,而在20～30 Hz的频段,雷帕霉素1 w组和假手术组最深能量最低,LID组色彩最淡,能量最高,见图4。场电位的功率谱分析见图5A,LID组在0～10 Hz低频范围内能量最高,雷帕霉素干预组在15～40 Hz处略微高于LID组。上述结果提示,LID纹状体神经元存在异常放电情况,雷帕霉素可以有效抑制纹状体神经元的异常放电,干预时间1 w与2 w对纹状体异常放电影响无明显差异。

图3 各组LFP信号

图4 各组LFP的时频分析

2.4雷帕霉素抑制LID簇状放电频率 LID组神经元簇状放电频率较假手术组及PD组明显升高(P<0.001),而在雷帕霉素处理1 w及2 w后神经元簇状放电频率均下降(P<0.05,P<0.01),雷帕霉素1 w及2 w组神经元簇状放电频率无统计学差异(P>0.05)。见表2、图5B。

3 讨 论

LID的发病机制目前尚未完全清楚。有研究显示mTOR信号通路在LID的发病过程中扮演重要角色〔10〕,使用mTORC1抑制剂雷帕霉素可以缓解6-OHDA诱导的PD大鼠长期摄入L-DOPA所发生的LID症状,这与D1R过度激活有关〔11,12〕。本研究同样证实了雷帕霉素可以显著改善LID大鼠的行为学症状,电生理研究显示LID状态下的大鼠纹状体神经元自发放电频率明显升高。多通道微电极阵列技术可以记录和检测到多个神经元胞外动作电位,即锋电位〔7〕。

这种技术能长时间对清醒动物中枢系统神经元放电活动进行监测和记录,研究发现〔13～15〕中枢系统神经元的电生理活动可随着动物的某些特定行为改变发生相应变化。多通道电极主要检测的指标包括神经元的放电频率、Burst发放频率、局部场电位、时频分析和功率谱分析。局部场电位时频分析及功率分析表明,在10 Hz以下的低频段(0～10 Hz)及中频段(20～30 Hz),纹状体神经元电活动减弱,予雷帕霉素干预1 w后,提示神经元电活动被有效抑制,雷帕霉素干预1 w和2 w其神经元电活动未见明显改变。而在高频段(15～40 Hz),LID组神经元电活动似乎略低于雷帕霉素干预组的神经元电活动,提示有可能在高频段区域,雷帕霉素干预后的神经元放电方式已发生改变。

综上,mTOR通路信号的异常激活是LID发生的重要环节,抑制mTOR通路的激活可作为治疗LID的靶点,为此类药物的开发提供一定依据。