噬菌体对多重耐药肺炎克雷伯菌所致小鼠肺炎和体外生物被膜的作用

李环羽，何帆

1.江西省人民医院（南昌医学院第一附属医院），江西 南昌 330006；2.江西省儿童医院，江西 南昌 330006

随着抗生素的广泛应用，临床上出现了越来越多的多重耐药肺炎克雷伯菌。其有着耐抗生素、毒性强、预后差、致死率高的特点，由此也给患者的家庭和社会带来了相应的经济负担。肺炎克雷伯菌容易耐药的原因之一，是该细菌易黏附于组织上皮或人工材料表面，形成生物被膜，使抗生素难以在其内部细菌中达到有效浓度［1-2］。烈性噬菌体能导致生物被膜的降解，然后通过吸附识别和溶菌迅速导致细菌的裂解死亡。噬菌体具有宿主特异性，灭病原体精度高，且增殖能力强，是高效的杀菌生物。本研究提取噬菌体和病原菌，分别进行了体内体外实验，研究噬菌体对克雷伯肺炎细菌的被膜抑制作用及对于肺炎小鼠模型的治疗效果，旨在获得多重耐药肺炎克雷伯菌肺炎的治疗新途径。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 实验动物选取80 只SPF 级的 BALB/C 雌性小鼠［6～8 周龄，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，生产许可证号：SYXK（京）2019-0008］。

1.1.2 仪器与试剂PBS（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI-9062）；甲醇（美国Thermo Fisher Scientific 公司，20211109）；BD Phoenix TM-100 全自动细菌鉴定系统（美国BD 公司）；LB 液体培养基（上海生工生物工程上海有限公司,批号：D605KA5760）；HH-B11 电热培养箱（天津天宇公司）；SW-CJ-1FD 超净工作台（杭州天诚公司）。

1.2 方法

1.2.1 致病菌和裂解性噬菌体的分离与鉴定（1）致病菌的分离鉴定。收集2019 年1 月至2021 年12月江西省人民医院（以下简称我院）检验科收取的肺炎病人的痰液样本进行病原菌的分离，经过分析证明该菌株具有克雷伯菌属的特征。

（2）裂解性噬菌体的分离鉴定。将制得的肺炎克雷伯菌制成宿主菌悬液，取10 mL 的处理前废水进行噬菌体富集。证明为裂解性噬菌体。

1.2.2 噬菌体效果的体外评估（1）噬菌体对细菌生长的抑制实验。用LB 液体培养基将菌液稀释至相应浓度用于体外抑菌实验。实验分为四组，B、C、D 三个实验组感染噬菌体复数分别为0.1、1、10，A 组（阴性对照组）不感染噬菌体。37 ℃、150 rpm 培养，吸光度值（OD）为在650 nm 下每隔 2 h测量一次。

（2）噬菌体对生物被膜的抑制实验。用液体培养基将对数期的菌液稀释至一定浓度，用于抑菌实验。在无菌96 孔板的l-3 列加入100 μL102cfu/mL 的菌液，4-6 列加入等量104cfu/mL 的菌液，7-9 列加入等量106cfu/mL 的菌液。A 行加入100 μL 磷酸盐缓冲液（PBS），B 行加入100 μL 效价为107pfu/mL的噬菌体。37 ℃、100 rpm 培养20 h。将96 孔板取出，倒掉培养物。用PBS 轻轻洗掉残留的培养物，晾干。甲醇固定15 min，每孔加入250 μL0.4%的结晶紫染色15 min。倒掉结晶紫，用双蒸水冲洗，晾干。

图1 噬菌体对生物被膜的抑制实验设计方案

1.2.3 体内治疗实验腹腔注射对所有小鼠 进行麻醉，滴鼻攻毒20 μL 细菌悬液，攻毒2 h 后，B、C、D 三个实验组 分别滴鼻20 μL 感染复数分别为0.1、1、10 的噬菌体，A 组（阴性对照组）滴鼻20 μL PBS。每12 小时记录死亡小鼠数量。

2 结果

2.1 噬菌体体外抑菌效果

在噬菌体加入12 h 内，A 组OD 650 值持续升高，B、C、D 三个实验组共培养物OD 650 值不稳定。感染复数（MOI）=10 吸光值下降最快，加入噬菌体的三个实验组，吸光值趋于稳定后远低于阴性对照组。见表1，图2。

表1 噬菌体与克雷伯菌共培养物在650 nm下的吸光度

图2 噬菌体与克雷伯菌共培养物在650 nm下的吸光度

2.2 噬菌体对生物被膜的抑制作用

结果显示加入噬菌体后明显抑制细菌生长。比较A、B 两行可以看出，加入噬菌体后可明显抑制细菌生长，培养基颜色正常。比较C、D 两行可以看出，7-9 列即106cfu/mL 的细菌经20 h 培养后能在96 孔板上形成生物被膜，107pfu/mL 的噬菌体能抑制生物被膜形成。见图3。

图3 对生物被膜的抑制作用

2.3 噬菌体对小鼠存活的影响

攻毒24 h，对照组小鼠全部死亡，感染复数为0.1的小鼠存活率为20%，感染复数为1 的小鼠存活率为55%，感染复数为10的小鼠存活率为85%。见表2，图4。

表2 噬菌体治疗肺炎小鼠的实验分组及各组小鼠结局观察

图4 不同感染复数（MOI）的小鼠存活影响

3 讨论

肺炎克雷伯菌是院内感染常见菌，伴随着抗生素的广泛应用，临床上出现了越来越多的多重耐药肺炎克雷伯菌。细菌常对多种抗生素耐药，毒力强，感染预后较差，病死率高（严重病例达50%）［3］。肺炎克雷伯菌容易耐药，因此要在体内消灭耐药性肺炎克雷伯菌的最佳思路，就是找到一种可以裂解且抑制表面生物被膜形成的特异性生物。研究表明，相对于游离细菌，生物被膜中的细菌可以抵抗10～1 000 倍浓度的抗生素［4］。本研究从检验科收集的患者痰液中提取并提纯获得一株克雷伯菌，并进行扩增得到稳定菌液，耐药性检测表明其为一株多重耐药肺炎克雷伯菌，符合耐药菌的一般特点，能够产超广谱B-内酰胺酶，对临床首选的A 类抗生素均已产生耐药性，可用于进行耐药菌的进一步实验检测。在体外和体内，通过控制感染复数作为变量，研究噬菌体对于不同感染复数的细菌感染肺炎的治疗和体外裂解效果。评估噬菌体在治疗细菌性肺炎时的作用。

耐药肺炎克雷伯菌感染首次出现在亚洲，随后难以治疗的耐药性疾病在世界各国均有发现［5］，造成的不良社会经济影响不容小觑［6］。人们曾经尝试使用免疫增强的手段实现对其的防治，但结果却不尽如人意的，浪费了大量的医疗资源并对患者的生命健康和家庭带来了重负。

烈性噬菌体能导致生物被膜的降解，然后通过吸附识别和溶菌迅速导致细菌的裂解死亡。噬菌体是高效的灭菌生物，具有特异性，且繁殖快。这种特点就决定了噬菌体可治疗肺炎克雷伯菌感染所导致的肺炎，是良好的生物灭菌剂［7］，并且不会伤及人体内其他菌类。噬菌体有着较长的细菌性疾病治疗历史［8］，近年来由于出现大量耐药菌，噬菌体的研究又重新回到了科研热点中。查阅国内外文献［9-10］，目前仅有少量研究是关于噬菌体和多重耐药肺炎克雷伯菌所致的肺组织感染的［11-14］。探讨噬菌体对气管插管表面细菌生物被膜的作用，以及噬菌体不同给药途径对小鼠肺炎作用的研究在国内尚无相关报道。本研究以我院检验科分离的多重耐药肺炎克雷伯菌肺炎亚种为宿主菌，从医院污水处理站处理前污水中分离相应的噬菌体，对其体外和体内杀菌能力进行评估，并对比不同 给药浓度进行体内杀菌试验的疗效。探索多重耐药肺炎克雷伯菌肺炎的治疗新途径。

本研究采用敏感的噬菌体来破坏多重耐药肺炎克雷伯菌形成的生物被膜，并通过不同给药 浓度治疗该细菌导致的小鼠肺炎，观察其疗效。本研究解决的技术关键在于对噬菌体进行分离、筛选和扩增。因此在分离噬菌体后，应采用相应的细菌进行筛选、验证，并将噬菌体与之共同培养，进行纯化、增殖，获得足量的噬菌体。实验结果显示，体外实验的吸光度值表明噬菌体在体外具有很好的裂解效果。噬菌体对小鼠感染肺炎的保护作用与感染复数呈正相关。

本研究的结果提示了噬菌体可用于临床治疗多重耐药肺炎克雷伯菌感染。探究了噬菌体治疗多重耐药菌感染引起小鼠肺炎的实际应用效果，说明噬菌体对多重耐药菌引起的感染具有治疗潜力，为今后多重耐药肺炎克雷伯菌肺炎提供了治疗新途径。