基于响应面的三叶青叶多糖的提取工艺和抗氧化活性研究*

龚来觐，李鹤，常青

江西农业工程职业学院 江西宜春 331200

三叶青主要分布于中国浙江、江西、福建、广西，用于治疗风湿性关节炎、祛痰、改善血液循环。现代药理学研究，三叶青具有抗炎[1-2]、抗肿瘤[3-4]、抗病毒[5]、和抗菌作用[6]，临床上广泛应用于治疗各种疾病，包括肺炎、病毒性脑膜炎、高热等[7]。

三叶青的药效和生物活性与其复杂的化学成分密切相关，近年来，研究者多集中于对三叶青块根及其黄酮组分成分和药效的研究[8-10]，鲜少对三叶青地上部分的研究，其中多糖是一种重要成分，从三叶青地上部分提取的多糖研究更少，此外，多糖具有抗氧化活性，可以清除过量的自由基以减少氧化损伤，这已被大量研究证实[11-12]。然而，三叶青叶多糖的抗氧化活性尚未研究。

本研究旨在结合超声波和酶的优势提取三叶青叶多糖。结合单因素实验和RSM的BBD，获得最佳提取条件，以碳水化合物的浓度来评估三叶青叶多糖的提取率。采用高效液相色谱法（HPLC）分析三叶青叶多糖的单糖组成。此外，用FRAP法、DPPH和羟自由基清除活性的研究揭示三叶青叶多糖的抗氧化活性。

材料与方法

1 材料和试剂

三叶青的地上由江西大茅山中药生物科技有限公司提供。维生素C、纤维素酶（木霉Vride G）、DPPH1、PMP、TFA（远野生物科技有限公司）；FRAP试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

2 设备

KQ-500DE超声波清洗机（中国昆山昆山超声波仪器有限公司）；真空冷冻干燥器（美国Labconco）；分光光度计（美国BioTek Epoch2）；安捷伦1260 HPLC系统（DAD检测器）。

3 方法

3.1 三叶青叶多糖的制备 取三叶青叶干粉2.0g，40mL95%乙醇在80℃回流1h，减压过滤，80℃干燥2h。超声波清洗机中，设计纤维素酶用量、时间、超声波提取功率、水料比和温度的，用去离子水提取干样品，过滤后以8000转/min的速度离心5min，从水提取物中获得上清液。然后，将三倍体体积的95%乙醇与上清液充分混合，并保持在4℃沉淀12h以沉淀多糖。以4000r/min的速度离心10min，以将沉淀物从有机溶剂中分离出来。再溶解的三叶青叶多糖溶液用Sevag试剂脱蛋白。然后剧烈摇晃和离心后得脱蛋白的三叶青叶多糖，真空冷冻干燥[13-15]。

3.2 三叶青叶多糖含量的测定 以D-葡萄糖为标准，用苯酚-硫酸法测定三叶青叶多糖的碳水化合物浓度[10]，供试品制备成三叶青叶多糖溶液：5%苯酚：98%硫酸为1:1:5的混合物，并在100℃下培养℃20min，490nm处测量混合物的吸光度，三叶青叶多糖的提取率（%）计算如下:

其中C是萄糖标准曲线计算的三叶青叶多糖的碳水化合物浓度；V是三叶青叶多糖溶液的体积；D是稀释系数；M是三叶青叶子粉末的重量。

3.3 三叶青叶多糖提取的单因素实验 单因素实验设计，纤维素酶用量（1、2、3、4和5%）、提取时间（20、40、60、80和100min）、提取功率（300、350、400、450和500 W）和水料比（v/W=10/1、20/1、30/1、40/1和50/1mL/g）。

3.4 基于RSM的三叶青叶多糖提取优化 根据单因素实验的四个条件的初步范围，如表1，以纤维素酶用量（%，XA）、提取时间（min，XB）、提取功率（W，XC）和水料比（mL/g，XD）为自变量，每个变量的三个水平表示为-1、0、1，用Design Expert12.0.3软件建立了一个3水平29次的BBD，以最大限度地提高三叶青叶多糖的提取率，29次实验运行和RSM结果如表2所示。四个自变量和响应变量之间的关系来自以下回归模型。

表1 Box-Behnken设计（BBD）中使用的自变量及其水平

表2 自变量和响应变量的Box-Behnken设计（BBD）

3.5 三叶青叶多糖抗氧化活性的测定

3.5.1 DPPH自由基清除活性的测定 以维生素C作为阳性对照，[16-18]将一系列三叶青叶多糖溶液（1.0-6.0 mg/mL）与0.04 mg/mL DPPH自由基乙醇溶液混合，然后避光条件下在37℃放置30min。519nm下测吸光度。通过以下等式计算DPPH自由基清除活性:

DPPH自由基清除活性% =[1-（A1-A2）/A0]

其中A0是无水乙醇+DPPH的吸光度；A1是三叶青叶多糖溶液+DPPH的吸光度；A2是三叶青叶多糖溶液+无水乙醇的吸光度

综上所述，健康教育在高血脂患者中有着重要的应用价值，有效的将血脂控制在正常范围内，提高患者自我管理能力。

3.5.2 羟自由基清除活性的测定 将一系列三叶青叶多糖溶液与9 mM FeSO4和0.1%（v/v）H2O2混合。向混合物中添加9毫摩尔水杨酸-乙醇溶液以开始反应，并在37℃下持续30min， 在510 nm处测量三叶青叶多糖样品和阳性对照品（维生素C）的吸光度。羟自由基清除活性计算为：

羟自由基清除活性 %=[1-（A1-A2）/A0]

其中A0是水杨酸在乙醇中被去离子水取代的吸光度；A1是三叶青叶多糖溶液的吸光度；A2是用去离子水取代的三叶青叶多糖溶液的吸光度。

3.5.3 FRAP法测定总抗氧化能力 使用FRAP试剂盒测量三叶青叶多糖的总抗氧化能力。将检测缓冲液、基质溶液和基质液（v/v，10:1:1）混合并在37℃预热10min，以制备FRAP工作溶液。制备FeSO4（0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mM）的标准溶液，以获得校准曲线。将5微升三叶青叶多糖溶液与160微升FRAP工作溶液混合，并在37℃下孵育10min，594nm处测量吸光度。以维生素C用作阳性对照。硫酸亚铁的浓度表示三叶青叶多糖的总抗氧化能力。

结 果

1 三叶青叶多糖提取的单因素实验

1.1 纤维素酶用量对三叶青叶多糖提取率的影响在提取温度55℃、时间60min、功率400瓦、水料比设置为30:1 mL/g条件下。如图1A所示，随着纤维素酶用量从1.0%增加到2.0%，三叶青叶多糖的提取率显著增加（P＜0.01），在2.0%的用量下达到峰值（4.452±0.143%）。然而，随着纤维素酶用量从2.0%增加到5.0%，三叶青叶多糖的提取率略有下降，差异不显著（P＞0.05）。因此，选择纤维素酶的用量（1.0%～3.0%）进行RSM实验。

图1 纤维素酶用量（A）、提取时间（B）、提取功率（C）和水料比（D）对三叶青叶多糖提取率的影响

1.2 提取时间对三叶青叶多糖提取率的影响 提取时间对三叶青叶多糖提取率的影响如图1B所示。在提取温度55℃、纤维素酶用量3.0%、功率400W和水与材料的比例设置为30:1 mL/g条件下。随着提取时间从20min延长到80min，三叶青叶多糖的提取率显著增加（P＜0.01），而随着提取时间的延长，三叶青叶多糖的提取率显著降低（P＜0.01）。提取时间为60min，提取率为（4.254±0.170）%。因此，RSM实验选择了40～80min的提取时间。

1.3 提取功率对三叶青叶多糖提取率的影响 如图1C.研究了提取功率对三叶青叶多糖提取率的影响。提取温度、纤维素酶用量、时间和水料比设置为55℃、3.0%、60min和30:1 mL/g。随着提取功率从300 W增加到400 W，三叶青叶多糖的提取率呈显著（P＜0.01）上升趋势，在400W时达到最大值（4.198±0.075）%。然而，当提取功率＞400 W时，其呈相反趋势。因此，RSM实验采用提取功率（350-450W）。

2 用响应面（RSM）优化三叶青叶多糖的提取

2.1 模型拟合 RSM数据分析由Design Expert 12.0软件执行。使用SPSS Statistics 20.0和ANOVA进行统计分析。P＜0.05具有统计学意义。RSM实验数据如表2所示。

获得回归方程，如下所示:

其中Y是三叶青叶多糖的提取率；XA为纤维素酶用量；XB是提取时间；XC是提取功率；XD是水与材料的比率。

使用Design Expert软件12.0对RSM数据进行方差分析的结果如表3所示。通过F检验和P值评估显著性。模型的P值＜0.0001，这证明了模型对提取的极端意义。拟合值5.58的缺失表明相对纯误差不显著。确定系数（R2）和调整测定系数（R2）分别为0.9612和0.9223，变异系数（C.V.）为3.45%。ADEQ精度为14.8105（＞4是理想的），表明该模型可以导航设计空间。

表3 RSM实验数据的方差分析

2.2 响应面分析 RSM分析显示为一系列三维响应面和二维等高线图（图2）。三维图（A1-F1）的陡度和二维等高线图（A2-F2）的形状解释了这些自变量之间的相互作用。陡峭的三维响应面和椭圆等高线图表明，两个变量之间的相互作用显著。相反，柔和的三维响应面和圆形等高线图表明相互作用不显著。此外，自变量对三叶青叶多糖提取率的影响也可以通过三维图的陡度来评估。如图2A1-C1所示，纤维素酶用量（XA）对三叶青叶多糖提取率的影响比提取时间（XB）、提取功率（XC）和水料比（XD）的影响更为显著。从图2D1-E1可以看出，很明显，提取时间（XB）对三叶青叶多糖提取率的影响比提取功率（XC）和水料比（XD）更为显著。同样，图2F1表明水与材料的比率（XD）对三叶青叶多糖提取率的影响比提取功率（XC）更为显著。此外，图2A2-F2表明，这四个变量之间的交互作用不显著。上述结论与表3中的线性系数和叉积系数完全一致。

图2 三叶青叶多糖提取率的响应面图

3 模型验证

通过响应面图分析和回归方程估计三叶青叶多糖提取的最佳条件为纤维素酶用量为2.25%，提取时间62.48 min，超声波提取功率400.32W，水料比29.86 mL/g。根据实际情况，对提取条件进行了修改，并在表4中列出。在最佳条件下，三叶青叶多糖的平均提取率为（4.694±0.053）%，符合预测的响应值（4.702%）。因此，该模型是可靠的，足以优化三叶青叶多糖的提取。

表4 最佳条件下的预测结果和实验结果

4 三叶青叶多糖的抗氧化活性

4.1 四氢卟啉的DPPH和羟自由基清除活性 图4中记录了三叶青叶多糖的DPPH和羟基自由基清除活性。显然，测定了三叶青叶多糖的DPPH和羟基自由基清除活性低于维生素C。三叶青叶多糖的DPPH自由基清除活性随着其浓度从1.0 mg/mL增加到5.0 mg/mL而显著增加（P＜0.01）。然而，当三叶青叶多糖浓度＞5.0mg/mL时，其DPPH自由基清除活性从（78.204±1.242）%提高到（80.392±0.975）%，差异不显著（P＞0.05）。类似的结果如图5B所示，在1.0 mg/mL的浓度下，三叶青叶多糖的羟基自由基清除活性为（53.876±0.638）%，而当三叶青叶多糖的浓度增加到4.0 mg/mL时，活性显著增加到（77.492±1.275）%（P＜0.05）。然而，在4.0、5.0、6.0和7.0 mg/mL的三叶青叶多糖浓度下，羟基自由基清除活性差异不显著（P＞0.05）。

图4 维生素C和三叶青叶多糖的DPPH（A）和羟基（B）自由基清除活性

图5 FRAP法测定总抗氧化能力

4.2 FRAP法测定总抗氧化能力 铁还原抗氧化能力（FRAP）是一种用于测定还原能力的经典且广泛使用的方法。[19－20]使用FRAP试剂盒测定三叶青叶多糖的总抗氧化能力（T-AOC），并进行回归分析方程如下：Y=2.733X-0.03874，R2=0.9985。如图4所示，维生素C的T-AOC显著高于三叶青叶多糖，三叶青叶多糖的 T-AOC随着浓度从1.0 mg/mL增加到7.0 mg/mL呈显著上升趋势（P＜0.01）。此外，三叶青叶多糖的浓度和抗氧化铁还原能力接近标准溶液。这些结果表明，三叶青叶多糖具有较强的总抗氧化能力，T-AOC与其浓度密切相关。

讨 论

在本研究中，使用超声波辅助酶法从三叶青叶子中提取多糖。在RSM优化的最佳条件下，三叶青叶多糖的提取率有效提高。纤维素酶用量和提取时间是影响产率的关键因素。在最佳条件下，三叶青叶多糖的平均提取率为（4.694±0.058）%，与预期值吻合较好。因此，RSM建立的模型很好地适用于三叶青叶多糖提取的优化，RSM可以为优化提供很大的指导。

研究中发现，三叶青叶多糖的铁还原能力的抗氧化能力接近标准溶液，这表明三叶青叶多糖具有较强的总抗氧化能力。DPPH和羟自由基清除活性的峰值分别为（80.388±0.972）%和（81.923±1.687）%。这表明三叶青叶多糖具有很强的抗氧化能力，但低于阳性对照。此外，当三叶青叶多糖在1.0～4.0mg/mL范围内时，三叶青叶多糖的羟自由基清除活性大于DPPH。然而，当三叶青叶多糖浓度＞4.0mg/mL时，其DPPH和羟自由基清除活性接近。这些结果表明，多糖有助于三叶青的抗氧化能力，它可以拓宽探索新抗氧化剂的视野。应进一步研究三叶青叶多糖的结构和生物活性，以扩大三叶青的开发和利用。