基于多元统计方法不同性别玉树牦牛肉挥发性风味成分差异比较研究

皮 立，谭 亮，曹俊虎

（1.中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810001；2.中国科学院藏药研究重点实验室，青海 西宁 810001；3.中国科学院高原生物适应与进化重点实验室，青海 西宁 810001）

由野牦牛通过长期驯化而来的牦牛（Bos gruniens）是青藏高原古老的畜种，是藏民族不可或缺的生产生活资料。长期低氧严寒环境的适应造就了高原牦牛肉高蛋白、低脂肪、风味香醇、营养丰富的优良品质[1-2]。玉树牦牛生存于平均海拔4 000 m以上的高海拔地区，与世隔绝的自然地理环境，让玉树牦牛保持了较多的野牦牛特征[3-4]，玉树牦牛体格在青海省4 个地方品种中最大。远离城市的自然环境造就了玉树牦牛肉绿色无污染、肉香浓郁、风味香醇的优良食用品质，成为高品质牦牛肉的代表。

玉树牦牛的研究主要集中在疫病防治[5-8]、抗逆生理[9-10]和饲养繁殖[11-14]等方面，对牦牛肉挥发性风味成分的研究重点在加工过程中肉风味的变化[15-16]。对不同性别舍饲牦牛肉的营养和食用品质分析结果表明，母牛的肌内脂肪含量、鲜味氨基酸含量以及粗蛋白含量均高于公牛[17]。研究不同性别西门塔尔牛肉质差异发现，母牛脂肪酸含量高、剪切力和水分含量低，肉质优于公牛[18]。然而，关于不同性别牦牛肉风味成分研究鲜见报道。

风味作为肉的重要品质指标，直接影响人们的购买意向。决定牦牛肉风味品质优劣的因素很多，主要与年龄、性别、生存环境、饲养方式和牦牛品种等有关。开展不同性别牦牛肉挥发性风味的研究，从中挖掘出不同性别牦牛肉风味的差异化合物，为扩充牦牛肉品质评价、分级和标准制订提供数据基础，可为牦牛肉资源的可持续开发利用与肉质加工提供数据支撑，为推动玉树牦牛肉产业发展提供理论依据。

本研究以不同性别玉树牦牛为对象，对产自治多县的玉树牦牛肉应用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry HS-SPME-GC-MS）技术进行挥发性化合物检测，结合主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）和气味活度值（odor activity value，OAV），对不同性别玉树牦牛肉挥发性风味成分进行区分鉴定，筛选不同性别玉树牦牛肉的关键风味化合物，为玉树牦牛肉品质控制增加新的理论依据，并为进一步扩大玉树牦牛肉产品的质控指标提供科学的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2022年9月，随机挑选在青海省玉树州治多县境放牧饲养的4～5 岁健康公、母牦牛各3 批次，共6 头，经停食24 h、停水2 h后屠宰，屠宰后立即采集左半胴体第10～14肋骨背最长肌500 g，装入干净的保鲜袋中，放入冷藏箱（0～4 ℃），带回西宁实验室，于－20 ℃保存，样品屠宰2 d后进行检测。

2-甲基-3-庚酮 上海西格玛奥德里奇贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

MS105DU分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Thermo 1300/TSQ8000Evo型气相色谱三重四极杆质谱联用仪 美国赛默飞世尔科技公司；SPME装置 上海安谱实验科技股份有限公司；手动固相微萃取进样针、DVB/CAR/PDMS萃取头（50/30 μm） 美国Supelco公司；DB-WAX石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 挥发性风味成分萃取

将肉样在自然状态下解冻，去除筋膜，切成肉丁，用液氮进行速冻，倒入粉碎机中进行粉碎，粉碎后称取5 g肉样放进20 mL样品瓶中，并加入5 mL饱和氯化钠溶液和2 µL 2-甲基-3-庚酮溶液（0.168 μg/mL）混合，放入转子后振荡并置于磁力搅拌器上，将老化好的萃取头插入样品瓶距离样品1 cm处，在60 ℃条件下吸附45 min后取出，并插入GC进样口，在250 ℃条件下解吸附4 min[19-20]。

1.3.2 GC-MS条件

DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），载气为He；载气流速1.0 mL/min；进样品和接口温度250 ℃；升温程序：初始温度40 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升温到150 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升温到200 ℃，并以20 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，不分流进样；离子源温度250 ℃；传输线温度250 ℃；质量扫描范围m/z30~600 u；溶剂延迟0 min[21-23]。

1.3.3 定性与定量分析

分析得到的质谱图经NIST 14和Wiley Library标准质谱库检索定性，从中根据匹配度（＞800）、保留时间及相关文献，人工解析并确定其化学结构，初步定性。选择质量浓度0.168 μg/mL的2-甲基-3-庚酮作为内标，按内标物峰面积对每个化合物进行定量分析。

1.3.4 OAV计算

OAV按下式计算[24-25]。

式中：Ci为化合物含量/（μg/kg）；OTi为该化合物在水中的嗅觉阈值/（μg/kg）。

1.4 数据处理

采用Excel软件和SPSS 24.0统计软件进行数据分析和PCA，采用单因素方差分析，用最小显著性差异法分析作多重比较，数据以平均值±标准差表示。采用SIMCA 14.1软件进行OPLS-DA和变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值分析。

2 结果与分析

2.1 不同性别玉树牦牛肉挥发性风味成分比较

由表1可知，共鉴定挥发性化学成分62 种，其中醛类17 种、酮类7 种、醇类10 种、烃类14 种、含硫化合物5 种、含氮含氧杂环化合物3 种和其他化合物6 种。玉树公、母牦牛肉共有组分52 种，主要为醛类、醇类、烃类和其他化合物。蔡雨静等[26]研究发现，牦牛肉挥发性风味成分主要由醛类、醇类和烃类构成，与本研究结果一致。朱青云等[27]报道，牦牛肉背最长肌挥发性风味成分主要由醛类、酮类、醇类和烃类组成，其中醛类含量最高，醇类和烃类含量较高。

表1 不同性别玉树牦牛肉中挥发性风味成分含量（n=3）Table 1 Contents of volatile flavor components in male and female Yushu yak meats (n = 3) ng/g

由图1可知，母牦牛肉挥发性成分总量高于公牦牛肉。玉树牦牛肉挥发性风味成分含量由多到少依次为醛类、醇类、烃类、其他化合物、酮类、含氮含氧杂环化合物、含硫化合物。母牦牛肉挥发性风味成分中含硫化合物、酮类、醇类和含氮含氧杂环化合物均高于公牦牛肉。公牦牛肉中醛类和烃类高于母牦牛肉，但差异不显著。

图1 不同性别玉树牦牛肉挥发性成分种类比较Fig. 1 Composition of volatile flavor components of male and female Yushu yak meats

玉树牦牛肉中醛类物质检出种类最多，共17 种，主要由壬醛、苯甲醛和十六醛等组成。公牦牛肉醛类物质含量高于母牦牛肉，但差异不显著。醛类物质由脂质氧化产生，由于其阈值较低，对肉类香气贡献大[28]。玉树牦牛肉醛类物质含量高，公、母牦牛的醛类化合物占比分别为57.77%、45.28%，远高于青海海晏牦牛的31.13%[21]、西藏斯布牦牛的24.31%[29]和西藏当雄牦牛的19.5%[30]。醛类化合物是玉树牦牛肉的主要特征风味成分。

玉树牦牛肉中醇类化合物主要有1-辛烯-3-醇、(E)-2-辛烯-1-醇、2-乙基-1-己醇和3,7,11-三甲基-1-十二醇。公牦牛肉中醇类化合物的含量和种类均低于母牦牛肉。醇类化合物也来源于脂肪氧化降解。1-辛烯-3-醇是重要的醇类化合物，其阈值低，对香气贡献大。母牦牛肉中1-辛烯-3-醇含量显著高于公牦牛肉（P＜0.05）。其他醇类化合物由于阈值较高，其对牦牛肉香气的贡献可忽略不计。

玉树牦牛肉中酮类主要有2,3-戊二酮、3-羟基-2-丁酮（乙偶姻）、4-苯基-2-丁酮等。3-羟基-2-丁酮具有浓郁的奶香[31]，让肉香味更丰富。玉树母牦牛肉的3-羟基-2-丁酮含量显著高于玉树公牦牛肉，其香味更浓郁。

综合分析可认为，玉树母牦牛肉挥发性成分品质更好。

2.2 不同性别玉树牦牛肉挥发性风味成分PCA结果

PCA的主要目的是剔除主成分中的随机误差，从而降低复杂问题的维数，并且最小化测量误差的影响[32-34]。对玉树公母牦牛肉挥发性风味成分进行PCA，筛选关键挥发性成分。

由图2可知，玉树公、母牦牛肉明显分离，聚为2类，其中母牦牛肉分别第1、4象限，公牦牛肉分布第2、3象限。由表3可知，从玉树牦牛肉挥发性成分中提出3 个主成分，累计贡献率为99.78%，其中PC1方差贡献率为89.37%，在3 个主成分中贡献率最高，能够代表玉树公母牦牛肉挥发性成分。PC1中贡献最大是辛醛、十六醛、2-乙基-1-己醇、十五醛、甲苯、壬醛、二乙二醇乙醚、1-辛醇、乙偶姻、反-2-辛烯-1醇、1-辛烯-3-醇（表4）。11 种关键挥发性风味成分由4 种醛类、4 种醇类、1 种烃类、1 种醚类和1 种酮类组成，可见醛类和醇类对玉树公母牦牛肉挥发性风味的贡献最大。

图2 不同性别玉树牦牛肉挥发性风味成分的PCA图Fig. 2 PCA plot of volatile flavor compounds in male and female Yushu yak meats

表3 玉树牦牛肉挥发性成分PCA中主成分特征值、贡献率和累计贡献率Table 3 Eigenvalues, contribution rates and cumulative contribution rates of first three principal components for volatile flavor components in Yushu yak meat

表4 主成分的旋转矩阵权重系数Table 4 Rotation matrix of principal components in terms of weight coefficient

蔡雨静等[26]在玉树牦牛肉前胸、前腿、背部、后腿4 个部位肉中共检测出57 种挥发性化合物，通过PCA筛选出6 种关键风味化合物，分别为苯甲醛、壬醛、2-乙基-1-己醇、间二甲苯、烯丙基甲基硫醚、2-乙酰吡咯，可用于区分玉树牦牛后腿肉和其他部位肉，其中壬醛、2-乙基-1-己醇是所有部位肉的共有关键风味化合物。朱青云等[27]对青海大通、刚查、天峻、祁连和甘德5 个地区牦牛肉3 个部位肉进行分析，共检测出34 种挥发性化合物，经PCA筛选出8 种化合物，十六醛、十八醛、壬醛、苯甲醛、正辛醇、2,3-戊二酮、乙偶姻、己酸是牦牛肉的关键挥发性风味成分。该结果中有4 种化合物与玉树公母牦牛肉的关键挥发性成分相同。导致这些结果差异的原因，不但与牦牛不同产地的海拔和水热条件有关，还与采样部位、萃取头类型和样品前处理方法有关。

2.3 不同性别玉树牦牛肉挥发性风味成分的OPLS-DA

OPLS-DA是一种多因变量对多自变量的统计方法，相对于无监督的PCA，其优点是可通过预设分类，尽可能去除未控制变量对数据造成的影响，使模型更易于解释[35-36]。

以牦牛肉中62 种挥发性风味成分为因变量，牦牛性别为自变量，进行OPLS-DA，由图3可知，玉树公、母牦牛肉被有效区分，其中母牦牛肉样品分布在第1、4象限，公牦牛肉样品分布在第2、3象限，为0.984，为1，模型预测指数（Q2）为0.996，模型拟合结果可接受[36]。经过200 次置换检验，Q2回归线与纵轴相交线小于零，模型不存在过拟合，模型验证有效。认为该结果可用于区分不同性别玉树牦牛肉的挥发性风味成分。

图3 不同性别玉树牦牛肉挥发性风味成分的OPLS-DA（A）和模型交叉验证结果（B）Fig. 3 OPLS-DA plot (A) and permutation test (B) of volatile flavor components in male and female Yushu yak meats

图4 玉树牦牛肉62 种挥发性风味物质的VIP值Fig. 4 VIP values of 62 volatile flavor compounds in Yushu yak meat

VIP值可以反映风味物质对模型分类的贡献程度[37]，VIP＞1可认为该变量为该判别模型的潜在差异物质，且VIP值越大说明该物质在判别过程中的贡献越大。根据VIP值确定14 种物质作为潜在差异物质（表5），包括4 种醛类（十六醛、壬醛、苯甲醛、十五醛）、5 种醇类（3,7,11-三甲基-1-十二醇、1-辛烯-3-醇、1-辛醇、反-2-辛烯-1-醇、2-己基-1-己醇）、2 种酮类（4-苯基-2-丁酮、2,3-戊二酮）、1 种烃类（十三烷）、1 种酸类（乙酸）及1 种酚类（丁基羟基甲苯）。这14 种关键差异风味化合物与PCA比较有7 种化合物（3 种醛类、4 种醇类）相同，表明两种多元统计方法得到的结果相似。玉树牦牛肉挥发性风味成分中醛类、醇类和酮类含量较高，尤其醛类和酮类由于阈值低，对挥发性风味的贡献更大。

表5 不同性别玉树牦牛肉的特征风味物质OAVTable 5 OAVs of characteristic flavor components in male and female Yushu yak meats

OAV主要用于衡量化合物在挥发性风味中的贡献程度[38]。由表5可知，OAV＞1的化合物有十六醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、4-苯基-2-丁酮、2,3-戊二酮；玉树公牦牛中苯甲醛OAV＞1；2-己基-1-己醇、乙酸的OAV＜0.1，认为其对牦牛肉挥发性风味的贡献不大。其余4 种物质由于饱和醇、酚类和烷烃的阈值均较高，对挥发性风味贡献不大，可以不考虑其对玉树牦牛肉风味的影响。

玉树牦牛肉挥发性风味的5 种关键差异物中OAV最高的3 种化合物是十六醛、壬醛和1-辛烯-3-醇。十六醛OAV值远高于其他4 种化合物，对玉树牦牛肉挥发性风味的贡献最大，为牦牛肉提供了果香。壬醛和1-辛烯-3-醇也是玉树牦牛肉的关键挥发性风味成分，为牦牛肉提供柑橘和蘑菇香味。比较玉树公牦牛和玉树母牦牛关键风味成分的OAV发现，玉树母牦牛中1-辛烯-3-醇、壬醛的OAV高于玉树公牦牛，表明玉树母牦牛肉的挥发性风味中水果香和蘑菇味更浓郁。

3 结 论

采用HS-SPME-GC-MS技术分析不同性别玉树牦牛肉的挥发性物质，运用PCA和OPLS-DA结合OAV，筛选不同性别玉树牦牛肉的关键差异风味化合物。玉树牦牛肉中共鉴定出挥发性风味成分62 种，主要为醛类、醇类和烃类。玉树牦牛肉中醛类化合物占比约为50%，远高于其他产地牦牛肉，醛类化合物是玉树牦牛肉的重要特征成分。比较玉树公、母牦牛肉挥发性风味成分含量认为，母牦牛肉的风味品质更好。对不同性别玉树牦牛肉挥发性成分进行分析，通过PCA筛选出11 种关键风味化合物，分别为辛醛、十六醛、2-乙基-1-己醇、十五醛、甲苯、壬醛、二乙二醇乙醚、1-辛醇、3-羟基-2-丁酮、反-2-辛烯-1醇、1-辛烯-3-醇；通过OPLS-DA结合OAV，确定十六醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、4-苯基-2-丁酮、2,3-戊二酮5 种物质为不同性别玉树牦牛肉挥发性风味关键差异物质。本研究结果对于区分不同性别玉树牦牛肉风味成分提供了科学依据，也为玉树牦牛肉风味品质控制和提高提供了数据支持。