不同品种诺丽果发酵前后品质、挥发性风味成分和抗氧化活性比较

田 亮，孙碧琪，毛祥飞，柳美穗，崔亚娟，刘 洋*

（1.海南西沙诺丽生物科技有限公司，海南 三亚 572024；2.北京科技大学 化学与生物工程学院，北京 100083；3.北京市营养源研究所，北京 100069）

诺丽（Morinda citrifoliaL.）是茜草科海巴戟属的一种植物，其果实被称为诺丽果。原产于东南亚、大洋洲和澳大利亚等，生长范围从波利尼西亚延伸到印度，遍布热带地区，在许多国家都有大规模的种植[1]。诺丽在我国主要分布于海南，按照叶片和果实形状可将其分为椭圆形叶大果、卵圆形叶大果和卵圆形叶小果三种类型。其中，椭圆形叶大果原产于印度尼西亚，卵圆形叶大果原产于美国夏威夷，卵圆形叶小果原产于我国西沙群岛，这3种诺丽皆为野生品种[2]。近年来，从西沙群岛引种在三亚驯化栽培的诺丽品种—西沙诺丽抗氧I号果，以及经过驯化后的卷叶型长果，此外也有其他不同果形及大小的果实随着驯化逐渐被区分开来，形成各具特色的诺丽品种。

诺丽被用于治疗一些疾病已有2 000多年的历史，它可以刺激免疫系统，从而抵抗细菌、病毒、寄生虫和真菌的感染，可以防止恶性肿瘤的形成和扩散，对高血压，心脏方面的疾病也具有一定的辅助治疗作用[3-4]。诺丽鲜果和诺丽发酵汁也具有清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力[5]，诺丽果汁还能显著降低老龄老鼠肝组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活力，降低血中脂质过氧化产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量[6]。诺丽果具有优越的抗氧化能力，可被加工为诺丽酵素保健产品。

近年来对诺丽果化学成分进行了广泛研究，已知被报道存在于果实中的生物活性化合物主要有东莨菪亭、酚类、黄酮、维生素C、环烯醚萜类、生物碱和甾醇等[9]。这些化合物对多种疾病的治疗均有良好的功效，具有出色的抗菌和抗氧化等生物活性[10-11]。诺丽果中挥发性化合物含量则决定着果实的整体气味，其中酯类、辛酸和己酸等含量影响着人们的食用意愿[14]。

目前，对诺丽果的研究多集中在单一品种功能性及发酵产品化学成分的研究[16]，对不同品种在同一个地方种植后的品质、挥发性成分及抗氧化活性研究较少。本研究为了比较不同品种诺丽果（卵圆形叶大果、椭圆形叶大果、卷叶型长果、西沙诺丽抗氧I号果）发酵前后品质、挥发性成分及抗氧化活性差异，通过常规方法检测其品质指标，采用气质联用（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）技术分析其挥发性风味成分，并通过其对羟基、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、DPPH自由基清除能力及还原力检测，考察诺丽酵素的抗氧化能力。旨在为探究不同品种的诺丽果酵素产业化生产奠定基础，为今后诺丽果的种植、加工提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

卵圆形叶大果、椭圆形叶大果、卷叶型长果、西沙诺丽抗氧I号果：海南省三亚红花村种植，四个品种诺丽果外观形态如下：

1.1.2 化学试剂

30%过氧化氢（分析纯）：广东广试试剂科学有限公司；水杨酸钠、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、六水合三氯化铁、三氯化铁、磷酸二氢钾、过硫酸钾（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇（分析纯）：广东光华科技股份有限公司；氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司；2,2'-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）：北京索莱宝科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

BS224S分析天平：德国赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；ZHWY-110X30往复式恒温水浴摇床：上海智诚分析仪器制造有限公司；T-6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国安捷伦公司；UPLC I-Class TQ-S超高效液相色谱质谱联用仪、50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头：美国Waters公司；SP-756P紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司制造；QL-902漩涡振荡仪：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；H1650医用离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；FD150N离心机：昆山前卫机械科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分析检测

总多酚（以没食子酸计）测定：参考团体标准T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中总多酚含量的测定分光光度法》；总黄酮（以芦丁计）测定：参照《保健食品功效成分检测方法》中的分光光度法；叶黄素测定：参考国标GB 5009.248—2016《食品安全国家标准食品中叶黄素的测定》；粗多糖测定：参考中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》；总皂苷测定：参考《保健食品及其原料安全性毒理学检验与评价技术指导原则》（2020 年版）；原花青素测定：参考地方标准DB12/T 885—2019《植物提取物中原花青素的测定紫外/可见分光光度法》；木质素测定：参考农业行业标准NY/T 3494—2019《农业生物质原料纤维素、半纤维素、木质素测定》；香草酸、绿原酸、没食子酸、阿魏酸、原儿茶酸、龙胆酸、咖啡酸、丁香酸、P-香豆酸、芥子酸、槲皮素测定：参考农业行业标准NY/T 3949—2021《植物源性食品中酚酸类化合物的测定高效液相色谱-串联质谱法》；香豆酸、东莨菪亭、环烯醚萜类（车叶草苷酸）、环烯醚萜类（去乙酰车叶草苷酸）测定：参考文献[17-18]的方法。

1.3.2 挥发性风味成分的测定

挥发性风味成分测定采用GC-MS法。

采用固相萃取（solid phase extraction，SPE）法提取，在40 ℃条件下加热，插入萃取头萃取5 min，后插入进样口解吸5 min。

气相色谱条件：Rtx-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm），升温程序为初始温度40 ℃；30 ℃/min升温至60 ℃；10 ℃/min升温至180 ℃；20 ℃/min升温至220 ℃，保温2 min。分流比15∶1，流速1 mL/min，载气为高纯氦气（He）。质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，进口温度230 ℃，离子源温度200 ℃，扫描范围35～450 m/z。

定性定量方法：测定结果通过美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）08标准质谱图库检索比对，并参考相关文献进行挥发性风味成分定性，采用峰面积归一化法进行挥发性风味成分定量。

1.3.3 诺丽果酵素的制备

分别挑选无腐烂4个品种的诺丽鲜果，经过清洗后沥干。将4种诺丽鲜果分别装入不锈钢罐，常温密封入罐发酵6个月，取出发酵后的诺丽果经离心机离心（800 r/min、滤布300目）过滤后取滤液，即得到诺丽果酵素。

1.3.4 抗氧化能力测定

（1）羟自由基清除能力测定

采用Fenton法[19]测定羟自由基清除率，其计算公式如下：

式中：A0为空白组吸光度值；A1为实验组吸光度值；A2为样品本底吸光度值。

2 结果与分析

2.1 诺丽鲜果品质分析

不同品种诺丽鲜果品质指标测定结果见表1。由表1可知，在四个品种的诺丽鲜果中，卷叶型长果总多酚、粗多糖、总皂苷、原花青素、木质素、去乙酰车叶草苷酸、槲皮素含量最高，分别为190 mg/100 g、380 mg/100 g、270 mg/100 g、4.56 mg/100g、3 000 mg/100 g、127 mg/100 g、0.095 6 mg/100 g。卵圆形叶大果总黄酮（以芦丁计）、东莨菪亭、车叶草苷酸含量较高，分别为48.4 mg/100 g、2.36 mg/100 g、93.2 mg/100 g。西沙诺丽抗氧I号果香草酸和叶黄素含量较高，分别为1.11 mg/100 g、36.1 mg/100 g，而椭圆形叶大果中品质指标普遍较低。

表1 不同品种诺丽果品质指标测定结果Table 1 Determination results of quality indexes of different varieties of Noni fruit mg/100 g

值得注意的是，卷叶型长果中的槲皮素比其他果实高出近10倍，近些年的研究表明，槲皮素由于其强大的抗氧化作用和促凋亡作用，因而可作为有效的抗衰老、抗癌药物[23]。卷叶型长果中的去乙酰车叶草苷酸和卵圆形叶大果中车叶草苷酸含量比其他两个品种果实高出数倍，环烯醚萜类化合物具有抗炎的功效[9，24]，并且除了可以抑制乙酰胆碱活性从而增强记忆力外，还具有通过降低血清中细胞因子水平从而增强血清抗氧化能力并抑制癌细胞发展的作用[25]，因此具有很高的药用价值，但在自然界可供食用的水果中并不常见。

酚类、原花青素、黄酮和东莨菪亭等化合物已经被多次报道存在于诺丽果中，并且均具有良好的抗氧化及抗菌效果，在本实验样品中测得的含量均高于以往报道中的其他品种[10，26]。从四个品种诺丽果中分离出的化合物大部分与果实的抗菌、抗氧化等功能相契合[27]，印证了诺丽果实强大的辅助治疗能力是来源于其内化合物这一事实。综合考虑，在以诺丽鲜果为原料生产的诺丽果干、诺丽果干粉时可以优先考虑使用卷叶型长果作为原料，其次可使用卵圆形叶大果，若需要提取大量叶黄素单一特色物质，则可以考虑使用西沙诺丽抗氧I号果。

2.2 诺丽果酵素品质分析

不同品种诺丽果酵素品质指标测定结果见表2。由表2可知，诺丽果酵素中，西沙诺丽抗氧I号果总多酚、总皂苷、原花青素、东莨菪亭、总环烯醚萜（车叶草苷酸和去乙酰车叶草苷酸）、原儿茶酸、咖啡酸、槲皮素含量较高，分别为150 mg/100 g、178 mg/100 g、4.94 mg/100 g、16.5 mg/100 g、242.6 mg/100 g、0.658 mg/100 g、1.25 mg/100 g、0.143 mg/100 g。卷叶型长果酵素多酚、黄酮含量较高，分别为190 mg/100 g、61.4mg/100g。卵圆形叶大果酵素粗多糖最高，为280mg/100g。椭圆形叶大果发酵后各种化合物含量有所增加，但与其他品种相比仍有不足。

发酵过程是植物内生微生物利用营养物质积累次生代谢物的过程，经过发酵的植物中化合物成分及含量会发生显著的变化[28]。诺丽果实的成熟过程十分短暂，其易腐的特性使发酵过程也易于进行，因此制作诺丽发酵汁主要采用自然发酵的方式[29]。与表1比较分析可知，4个品种诺丽果在发酵后成分含量均发生了变化，去乙酰车叶草苷酸和东莨菪亭含量因代谢而在总体上大幅增加，卵圆形叶大果酵素和西沙诺丽抗氧I号果酵素中尤甚，但在卷叶型长果中增加较少；香草酸也有略微增加，在卷叶型长果和椭圆形叶大果中增加更多。诺丽果中的叶黄素和木质素主要存在于果渣中，而酵素中含量很少，因此发酵后含量大幅下降；车叶草苷酸和皂苷在发酵汁中含量也呈现总体下降的趋势。

四个品种诺丽果发酵前后品质变化的原因，推测：第一，由于微生物的作用，会消耗一些营养物质，导致部分物质下降；同时微生物也会产生一些次级代谢产物，导致部分物质上升；第二，物质与物质之间可能会进行相互反应，从而产生新的代谢物；第三，在发酵过程中与氧气结合发生氧化反应，导致一些物质因为氧化而降解。具体某一种物质的变化机理还需更进一步研究。

不添加任何辅助原料的自然发酵过程使得果实中的微生物利用原有的化合物进行代谢活动，发酵后诺丽果部分成分含量下降，比如多糖。微生物产生的水解酶可将不溶性果胶纤维素细胞壁降解为可溶性多糖，并将多糖分解为低聚糖或单糖，导致发酵过程中多糖浓度的减少[30]。而鲜果中占比较大的功能性化合物，如多酚、黄酮等，含量的变化可能是由于复杂的多酚在发酵过程中被酶分解为更简单的黄烷醇[31]。但四个品种诺丽发酵汁中多酚和黄酮含量的增减并不显著，其他功能性化合物含量也普遍呈增加趋势，表明对诺丽果进行发酵后，酵素中化合物的成分含量虽有变动，但并不影响果实原有的主要功能，还会使一些特色成分的含量增加，与鲜果的优势不同。对比以往报道，测定的四种诺丽果实与其酵素所含功能性化合物的平均含量要更高一些[10]，可以看出诺丽鲜果和诺丽果酵素在工业生产中均具有很大潜力。从品质指标综合表现，西沙诺丽抗氧I号果进行发酵生产最为适宜，其次是卵圆形叶大果。

2.3 诺丽果酵素挥发性风味成分测定

四个品种的诺丽果酵素中挥发性风味成分含量GC-MS分析结果见表3。由表3可知，四个品种的诺丽果酵素中共鉴定出31种挥发性风味成分，其中酯类17种，酸类8种，醇类4种，呋喃类1种和酮类1种。卵圆形叶大果、卷叶型长果、椭圆形叶大果、西沙诺丽抗氧I号果中分别共检出20种、20种、18种、20种挥发性风味成分。酯类在果汁风味中起着重要作用，己酸甲酯是普遍存在于果实中的成分，它和水杨酸甲酯在果实中表现出明显的花果香。酸类也是新鲜诺丽果中含量较大的挥发性风味成分，辛酸和己酸是所有样品中最重要的酸性化合物，其气味类似于奶酪和汗液，具有微弱的刺激性特征[32]。3-甲基-3-丁烯-1-醇的存在使果实具有草本气味[33]，2-庚酮会产生奶酪状气味，2-乙酰基呋喃通常在食物中呈现焦甜味[34]。含硫化合物可能会对果汁的感官特性产生负面影响，诺丽果酵素通常会产生令人不快的气味和味道，类似大蒜、洋葱或硫磺[32]，这些主要挥发性风味物质共同构成了诺丽果酵素复杂的植物气味。

在四种诺丽果实中，卷叶型长果酵素的刺激性气味相比于其他品种更弱一些，酯类物质（己酸甲酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯）含量较高，酸类的含量在四个品种中最低；而西沙诺丽抗氧I号果酵素中酯类和酸类和2-庚酮含量均为最高，气味较为浓郁；椭圆形叶大果酵素整体上气味更为单一，检测出的成分种类为四种果实里最少；卵圆形叶大果中酸的含量较高，酯类含量较少，气味较其他果实更刺鼻。研究表明，随着果实发酵，酸的含量会逐渐降低，果实的刺激性气味也会相应缓和[35]。从挥发性风味成分测定结果来看，选择西沙诺丽抗氧I号果诺丽果品种制备诺丽果酵素最佳。

2.4 不同品种诺丽果酵素的抗氧化活性

不同品种诺丽果酵素的抗氧化活性测定结果见表4。由表4可知，椭圆形叶大果酵素、卵圆形叶大果酵素、西沙诺丽抗氧I号果酵素、卷叶型长果酵素对羟自由基清除能力分别为73.2%、82.5%、78.5%、75.5%，其卵圆形叶大果酵素羟自由基清除能力最强。

表4 不同品种诺丽果酵素的抗氧化活性测定结果Table 4 Determination results of antioxidant activities of Jiaosu with different varieties of Noni fruit

实验利用铁离子还原力，在波长700 nm处的吸光度值高低可以间接反映抗氧化性大小，吸光度值越大，还原力越强，反映其抗氧化活性越强。由表4可知，椭圆形叶大果酵素、卵圆形叶大果酵素、西沙诺丽抗氧I号果酵素、卷叶型长果酵素的还原力分别为0.350、0.553、0.594、0.544。四种诺丽果酵素中，还原力最强的是西沙诺丽抗氧I号果酵素；最弱为椭圆形叶大果酵素。

ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色ABTS自由基离子溶液，可与能清除自由基的样品反应，从而使之褪色。根据在波长734 nm处测定吸光度值，吸光度值的大小可评价样品抗氧化活性能力。由表4可知，西沙诺丽抗氧I号果酵素、椭圆形叶大果酵素、卵圆形叶大果酵素和卷叶型长果酵素对ABTS自由基清除率分别为79.3%、68.5%、70.1%、65.9%，西沙诺丽抗氧I号果酵素的ABTS自由基清除能力最强。

DPPH自由基的醇溶液呈紫色，可与能清除自由基的样品反应，使其颜色变浅，吸光度值的大小可判断样品的抗氧化能力。由表4可知，西沙诺丽抗氧I号果酵素、椭圆形叶大果酵素、卵圆形叶大果酵素和卷叶型长果酵素对DPPH自由基的清除能力分别为74.1%、63.0%、60.1%、60.1%；西沙诺丽抗氧I号果酵素对DPPH 自由基的清除能力最强。

综上，不同品种的诺丽果酵素其抗氧化活性效果存在差异，西沙诺丽抗氧I号果酵素的还原能力、ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力优于其他3种，卵圆形叶大果酵素羟自由基清除能力最强。

3 结论

本研究对不同品种诺丽果及诺丽果酵素的品质指标、挥发性成分及抗氧化活性进行了检测，结果表明，诺丽鲜果中卷叶型长果的总多酚、粗多糖、总皂苷、原花青素、木质素、去乙酰车叶草苷酸、槲皮素含量最高，综合表现最好。而诺丽果酵素中西沙诺丽抗氧I号果酵素的总多酚、总皂苷、原花青素、东莨菪亭、总环烯醚萜（车叶草苷酸和去乙酰车叶草苷酸）、原儿茶酸、咖啡酸、槲皮素含量最高，综合表现最好。西沙诺丽抗氧I号果酵素风味更加浓郁，刺激性气味柔和，更让人易接受。

综上所述，从工业生产角度考虑，生产诺丽果干或诺丽果干粉等产品建议选择卷叶型长果；生产以诺丽果发酵制品，推荐西沙诺丽抗氧I号果。未来可以通过控制代谢来寻找不同品种果实最适宜的发酵时长，从而通过工业生产获得更多的有益化合物，为药用植物的工业产品生产提供更多思路。