茶树土壤耐高温多功能溶磷生防凝结芽孢杆菌及其抑制茶树炭疽病原活性研究

2023-09-28姜春玲韩姝祯张政雄

福建茶叶 2023年9期

姜春玲，韩姝祯，张政雄,3*

(1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2.宁德师范学院生命科学学院；3.科技厅产学研合作示范基地，福建宁德 352100)

在我国，茶种植和相关产业链是国家所提倡的科技下乡、精准扶贫及乡村振兴等的重要产业之一[1,2]。但随着我国各地的茶树栽培面积随年逐渐增加，茶树种植品系过少，过度使用化学肥料和农业等原因，造成各地茶园的各种霉菌病害日益严重，严重影响了各种品系茶叶或茶油的产量和品质，也同时限缩和制约茶叶相关产业的发展和营收，尤其以茶树炭疽病（Gloeosporium sp.and Colletotrichum sp.）较为好发且严重的茶树霉菌病害，在我国各地茶树种植产区均有出现或暴发疾病，尤其在高温潮湿的季节或年份，发病情况更为频繁严重，影响茶农收益和茶产业获利甚巨[3,4]。

本研究拟找寻具有高抑制多种茶树炭疽病原活性的耐高温多功能溶磷生防微生物，其耐高温生长特性可应用于生物肥料制作[5,6]，而中温特性则可施放于茶园田间和帮助茶树等植物的生长和对抗多种茶树炭疽病原的入侵和感染[7]。因此也拟应用这些耐高温多功能溶磷生防微生物于肥力丰富、高可溶性磷浓度及强抑制多种茶树炭疽病原活性的多功能生防生物磷肥的制备、工业化量产及商品化，深具有机农业、资源回收、环境保护、绿色有机茶业等永续经营发展的应用价值。

1 材料与方法

1.1 供试耐高温多功能溶磷生防凝结芽孢杆菌分离株

供试耐高温多功能溶磷生防凝结芽孢杆菌分离株为凝结芽孢杆菌分离株Bacillus coagulans isolate ppx-13，分离自福建省福鼎市福建品品香茶业有限公司管阳河山茶园的福鼎白茶茶树根际土壤，采样日期为2021年01月23日[7]。

1.2 供试茶树炭疽病原分离株

供试茶树炭疽病原分离株为茶树炭疽病霉菌病原分离株N425、茶树炭疽病霉菌病原分离株ZN81及油茶炭疽病霉菌病原分离株DH9，均为本实验室于我国各地茶园中患茶树炭疽病的茶树病叶上所分离出。

1.3 中温和耐高温溶磷活性侦测

分别以PVK培养基、以磷矿石为唯一磷源的改良式PVK培养基及以植酸钙为唯一磷源的改良式PVK培养基平板检测法于25和50℃培养5天后侦测供试耐高温微生物的中温和耐高温溶磷酸钙、溶磷矿石及植酸酶活性[5]。

1.4 中温和耐高温酶活性侦测

分别以含可溶性淀粉为唯一碳源的改良式Mandels-Reese培养基、含羧甲基纤维素钠为唯一碳源的改良式Mandels-Reese培养基、含几丁质为唯一碳源的改良式Mandels-Reese培养基、含果胶质为唯一碳源的改良式Mandels-Reese培养基、含木聚糖为唯一碳源的改良式Mandels-Reese培养基、三丁酸甘油酯培养基及脱脂奶粉培养基平板检测法分别于25℃和50℃培养5天后侦测供试耐高温微生物的中温和耐高温淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶、果胶质酶、木聚糖酶、脂肪酶及蛋白酶活性[5]。

1.5 中温抑制茶叶炭疽病病原菌活性测试

以本实验室所分离茶叶炭疽病病原菌-胶孢炭疽菌N425、茶树炭疽病霉菌病原分离株ZN81及油茶炭疽病霉菌病原分离株DH9为靶标菌株。其菌丝体液态发酵液以马铃薯葡萄糖液态培养基于25℃和200rpm培养5天后收获得，并以无菌操作方式进行以下实验操作。于4℃及10,000rpm离心20分钟下，倾倒上清液取得湿菌丝体细胞沈淀固型物。湿菌丝体细胞沈淀固型物使用2倍重量的无菌生理食盐水进行重新悬浮，以制备菌丝体悬浮液。取适量约200克的菌丝体悬浮液以组织粉碎机经约10秒-15秒的粉碎后，再以显微镜检计数经此适当粉碎条件的菌丝体悬浮液的菌丝片段数，之后以无菌生理食盐水进行适当倍数稀释以制备成每mL约有1×106菌丝片段的菌丝悬浮液。之后在分别涂抹100μL的每mL约有1×106菌丝片段的菌丝悬浮液至营养琼脂平板（NA）和马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板（PDA）上，再以平板检测法于25℃培养5天后，进行供试耐高温微生物的中温抑制茶叶炭疽病病原菌活性侦测。

1.6 统计分析

数据以平均值±标准偏差（means±SD）表示。以The Independent-Sample T-Test比较平均值之间差异。以Statistical Analysis System Software在Tukey's Honestly Significant Difference（P=0.05、0.01及0.001）条件下用the General Linear Model using type II sum of squares模式进行the variance homogeneity determination（ANOVA）分析[8]。

2 结果与讨论

2.1 多样性溶磷活性

如表1所示，耐高温多功能性溶磷生防凝结芽孢杆菌分离株ppx-13于25℃和50℃培养时，于3种不同溶磷活性侦测培养基上均可生长和表现多样性溶磷活性，而于50℃培养时优于25℃，指出此菌于高温时较容易生长和表现多样性溶磷活性。耐高温多功能性溶磷生防凝结芽孢杆菌分离株ppx-13也有植酸酶活性，因此同时可溶解无机和有机磷源。

表1 耐高温多功能性溶磷生防凝结芽孢杆菌分离株ppx-13于25和50℃培养时所表现多样性溶磷活性

2.2 多样性酶活性

如表2所示，耐高温多功能性溶磷生防凝结芽孢杆菌分离株ppx-13于25℃和50℃培养时，可表现7种分解有机物活性，且于50℃培养时优于25℃，指出此菌于高温时较容易生长和表现多样性酶活性。应用耐高温多功能性溶磷生防凝结芽孢杆菌分离株ppx-13于茶园土壤，可期有加速有机质分解与碳氮磷循环的功能，有助于土壤养分的流动及提供营养给植物和土壤微生物，进而优化土壤环境和增进土壤生态系的多样性[7]。接种耐高温多功能性溶磷生防凝结芽孢杆菌分离株ppx-13于堆肥或生物肥料中，其所表现的耐高温生长和多样性酶活性将可加速堆肥或生物肥料的腐熟，以缩短其工业化量产时间，并可促进养分流动和微生物族群的生长，以提升其肥力和品质[5,6]。

表2 耐高温多功能性溶磷生防凝结芽孢杆菌分离株ppx-13于25和50℃培养时所表现多样性酶活

2.3 抑制多种茶树炭疽病原活性

如表3所示，耐高温多功能性溶磷生防凝结芽孢杆菌分离株ppx-13于25℃培养时，于NA或PDA上均可表现抑制3种茶树炭疽病原活性，且PDA平板检测法所得的结果优于NA。此结果指出，在霉菌生长代谢较佳的PDA，高温多功能性溶磷生防凝结芽孢杆菌分离株ppx-13仍可表现较佳抑制3种茶树炭疽病原活性，因可推知在茶园土壤环境适合茶树炭疽病原生长时，高温多功能性溶磷生防凝结芽孢杆菌分离株ppx-13应可对其维持高抑制活性，以保护茶树不受其侵染。