白皮杉醇对糖尿病心肌病模型大鼠的治疗机制研究

金秦然 陈翩翩

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病患者死亡的主要原因之一。DCM 可导致心力衰竭，包括心肌细胞肥大、坏死以及心肌纤维化[1-3]。氧化应激、炎症、心肌能量代谢和钙平衡异常是DCM 的发病机制[4-6]。白皮杉醇（Pic）是白藜芦醇衍生物，主要存在于葡萄、大黄、甘蔗等植物中。Pic 是一种多酚类化合物，具有多种生物学活性，有抗炎、抗氧化、提高机体免疫力等作用[7-10]。此外，Pic 对高胆固醇血症、动脉粥样硬化和血管生成具有正向作用[11]，表明其在心血管疾病中有一定治疗潜力。本文主要研究Pic 对DCM 模型大鼠的治疗作用及机制。

1 材料与方法

1.1 试 剂 大鼠心肌细胞H9c2（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号G4511）。链脲佐菌素（STZ，Sigma 公司，批号S0130）；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物科技有限公司，批号20190220、20190307）；原位末端凋亡法（TUNEL）检测试剂盒（上海碧云天生物技术公司，批号C1088），苏木素伊红染色（HE）试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20220324），天狼猩红染色试剂盒（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号GP1033），CCK-8 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号CA1210），核因子-κB（NF-κB）p65 抗体（碧云天生物有限公司，批号AF1234）。

1.2 大鼠心肌细胞H9c2 的培养 将大鼠心肌细胞H9c2 分为正常组、高糖（HG）组和HG+Pic 组。H9c2大鼠心肌细胞在含有5.5 mmol/L 葡萄糖、10%FBS、100 U/mL 青霉素，以及100 mg/mL 链霉素的DMEM 培养基中培养，而HG 组细胞被孵育在含有33 mmol/L葡萄糖的DMEM 中。将细胞以5×105/mL 密度接种在培养皿中，并在37 ℃下孵育24 h。将正常组细胞和HG 组细胞以8000 个/孔的密度接种在96 孔板中，孵育24 h 后，HG 组细胞给予0.01 mmol/L Pic 后继续培养，在培育24、48 h 时，分别统计细胞的活性。H9c2 细胞在HG 中培养后，给予Pic 继续培育48 h。经4%的多聚甲醛固定，洗涤，封闭，一抗（p65 抗体），荧光标记二抗以及细胞核DAPI 荧光染色，封片即可，通过p65 细胞免疫荧光染色实验对比三组细胞p65 水平。

1.3 DCM 模型建立及分组 健康的7～8 周龄SD 大鼠48 只，雄性，清洁级，体质量（200±20）g，均购自上海斯莱克实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2015-0009，所有动物实验经温州医科大学实验动物中心机构动物伦理与使用委员会批准，伦理审批号：wydw2016-0282。将大鼠饲养在20～24 ℃、湿度45%～55%，12 h 循环照明的环境中，自由摄食饮水。按照随机数字表法将48 只大鼠分为正常组、DCM 组、Pic-L 治疗组和Pic-H 治疗组，每组12 只。DCM 组、Pic-L 治疗组和Pic-H 治疗组大鼠单次腹腔注射70 mg/kg STZ，注射后3 d 空腹血糖＞16.7 mmol/L则成功建立糖尿病模型，6 周后即可发生DCM[12-15]。正常组大鼠则给予等剂量PBS 溶液。造模成功后，Pic-L 治疗组、Pic-H 治疗组分别予5、10 mg/（kg·d）的Pic 灌胃，正常组、DCM 组予等量生理盐水灌胃，连续给药12 周。

1.4 常规超声检查评价大鼠心功能 药物治疗结束后，将各组大鼠吸入式麻醉，仰卧位固定，褪去前胸毛发，对大鼠进行常规超声在体检查，记录左心室舒张末期直径（LVIDd）、左心室后壁（LVPW）和左心室收缩率（LVFS）。

1.5 大鼠血糖以及心脏质量/体质量比（HW/BW）检测 将大鼠固定在固定器中，用刀片划破大鼠尾尖，从尾根轻柔至尾尖，血液自然流出，采集至血糖试纸上，插入血糖仪检测血糖。大鼠通过腹腔注射过量戊巴比妥钠麻醉安乐死，取出心脏称重，计算HW/BW：大鼠的心脏质量与体质量的比值。

1.6 大鼠心肌组织SOD、MDA 水平 另取部分心肌组织，用生理盐水洗净后，滤纸吸干水分，将生理盐水与组织以9∶1 的比例加入离心管中，用眼科小剪刀将组织剪成小碎片，然后用组织匀浆机制成10%心肌组织匀浆液，严格按照酶联免疫吸附试验试剂盒操作说明书测定心肌组织SOD 和MDA 含量，评价各组大鼠的氧化应激水平。

1.7 病理学评价 将大鼠心脏固定在4%的多聚甲醛中，石蜡包埋，制备成5 μm 切片，分别进行HE 染色观察大鼠心肌形态与排列、天狼猩红染色观察大鼠心肌胶原沉积情况、转化生长因子β1（TGF-β1）免疫组化染色观察心肌细胞炎症情况，TUNEL 染色观察心肌细胞凋亡情况。

1.8 统计学方法 应用GraphPad Prism 9 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（±s） 表示，多组比较采用单因素方差分析，多重比较采用Dunnett’s t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Pic 增强HG 环境下H9c2 心肌细胞活性 HG环境下的细胞活性比正常组细胞的活性下降，而给予Pic 培育24 h 后，细胞活性较HG 组增加，但差异无统计学意义（P＞0.05），在培育48 h 时，HG+Pic 组的细胞活性依旧高于HG 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 H9c2 细胞活性（%，±s）

表1 H9c2 细胞活性（%，±s）

注：正常组细胞培育在含有5.5 mmol/L 葡萄糖的DMEM 中；HG 组细胞培育在含有33 mmol/L 葡萄糖的DMEM 中；HG+Pic 组细胞为培育在含有33 mmol/L 葡萄糖的DMEM 中且给予0.01 mmol/L 白皮杉醇；与正常组比较，aP＜0.05；与HG 组比较，bP＜0.05

组别正常组HG 组HG+Pic 组24 h 100.00±9.54 81.33±6.03a 96.67±5.13 48 h 100.00±7.94 84.67±4.93a 102.00±5.57b

2.2 Pic 抑制高糖诱导的NF-κB 活化 通过免疫荧光染色评估在HG 诱导的H9c2 细胞中，NF-κB 激活的情况下发生p65 的核易位。在正常组中，p65 定位于细胞质，在HG 条件下，NF-κB p65 核易位加速，p65 会定位于细胞核中，但给予Pic 处理后可逆转该现象，见图1。

图1 p65 免疫荧光染色（×600）

2.3 Pic 可改善DCM 大鼠心功能 与正常组比较，DCM 组大鼠的LVIDd 和LVFS 下降（P＜0.01），LVPW上升（P＜0.01）；与DCM 组比较，Pic-L 治疗组和Pic-H 治疗组的LVIDd 和LVFS 升高（P＜0.01），LVPW 下降（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠心功能指标（±s）

表2 各组大鼠心功能指标（±s）

注：Pic-L 治疗组大鼠灌胃白皮杉醇5 mg/（kg·d），连续灌胃12 周；Pic-H 治疗组大鼠灌胃白皮杉醇10 mg/（kg·d），连续灌胃12 周；正常组和DCM 组灌胃同等剂量生理盐水，连续灌胃12 周；DCM 为糖尿病心肌病；LVIDd 为左心室舒张末期直径；LVFS 为左心室收缩率；LVPW 为左心室后壁；与正常组比较，aP＜0.01；与DCM 组比较，bP＜0.01

组别正常组DCM 组Pic-L 治疗组Pic-H 治疗组鼠数12 12 12 12 LVIDd（mm）7.11±0.13 5.64±0.13a 6.50±0.16b 7.41±0.09b LVFS（%）50.43±0.81 36.10±0.40a 44.83±1.36b 46.77±0.99b LVPW（mm）1.48±0.04 1.69±0.05a 1.59±0.05b 1.52±0.02b

2.4 Pic 改善DCM 大鼠血糖水平和HW/BW 值 与正常组比较，DCM 组大鼠的血糖和HW/BW 均升高（P＜0.01）；与DCM 组比较，Pic-L 治疗组大鼠血糖下降（P＜0.01），HW/BW 比值有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；Pic-H 治疗组血糖和HW/BW 比值均降低（P＜0.01 或P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血糖与HW/BW 值（±s）

表3 各组大鼠血糖与HW/BW 值（±s）

注：Pic-L 治疗组大鼠灌胃白皮杉醇5 mg/（kg·d），连续灌胃12 周；Pic-H 治疗组大鼠灌胃白皮杉醇10 mg/（kg·d），连续灌胃12 周；正常组和DCM 组灌胃同等剂量生理盐水，连续灌胃12 周；DCM 为糖尿病心肌病；与正常组比较，aP＜0.01；与DCM 组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

组别正常组DCM 组Pic-L 治疗组Pic-H 治疗组鼠数12 12 12 12血糖（mmol/L）6.30±0.20 25.13±1.74a 19.47±1.21c 13.70±2.18c HW/BW（mg/g）2.60±0.36 5.20±0.46a 4.73±0.68 3.70±0.46b

2.5 Pic 抑制DCM 大鼠心肌细胞氧化应激反应 与正常组大鼠比较，DCM 组大鼠SOD 下降（P＜0.01），MDA 上升（P＜0.01）。与DCM 组大鼠相比，Pic-L 治疗组和Pic-H 治疗组大鼠心脏组织SOD 水平升高（P＜0.01），MDA 水平降低（P＜0.01）。见表4。

表4 各组大鼠心肌组织SOD、MDA 水平（±s）

表4 各组大鼠心肌组织SOD、MDA 水平（±s）

注：Pic-L 治疗组大鼠灌胃白皮杉醇5 mg/（kg·d），连续灌胃12 周；Pic-H 治疗组大鼠灌胃白皮杉醇10 mg/（kg·d），连续灌胃12 周；正常组和DCM 组灌胃同等剂量生理盐水，连续灌胃12 周；DCM 为糖尿病心肌病；SOD 为超氧化物歧化酶；MDA 为丙二醛；与正常组比较，aP＜0.01；与DCM 组比较，bP＜0.01

组别正常组DCM 组Pic-L 治疗组Pic-G 治疗组鼠数12 12 12 12 SOD（U/mg protein）83.69±2.48 45.33±3.96a 59.41±1.98b 72.30±3.99b MDA（nmol/mg protein）3.11±0.12 5.05±0.26a 4.19±0.18b 3.55±0.13b

2.6 Pic 改善DCM 大鼠心肌纤维化 HE 染色结果显示，正常组大鼠的心肌细胞完整，且排列整齐、致密，无间质水肿；而DCM 组大鼠的心肌细胞排列紊乱且形态变异，心肌纤维存在明显的损伤和断裂，且心肌细胞间隙增大。给予Pic 治疗后，大鼠的心肌细胞排列较为完整、整齐，且心肌纤维的断裂情况有所减轻。天狼猩红染色结果显示，与正常组大鼠相比，DCM 大鼠心肌胶原沉积现象明显增加，心肌间质存在纤维化，而给予Pic 治疗后，能降低DCM 大鼠胶原沉积现象。见图2。

图2 各组大鼠心肌组织染色（×200）

与正常组大鼠比较，DCM 组大鼠心脏切片中TGF-β1 表达上升；与DCM 组比较，Pic-L 治疗组和Pic-H 治疗组大鼠心脏切片中TGF-β1 表达下降。见图3。

图3 各组大鼠心肌组织的TGF-β1 免疫组化染色（×200）

2.7 Pic 降低糖尿病诱导的心肌细胞凋亡 与正常组大鼠比较，DCM 组心肌细胞凋亡加重；相较于DCM 组，Pic-L 治疗组和Pic-H 治疗组心肌细胞凋亡现象减轻。见图4。

图4 各组大鼠心肌组织TUNEL 染色（×400）

3 讨 论

DCM 的发生机制复杂，涉及氧化应激、炎症反应以及细胞凋亡等多重病理生理过程，多种信号通路参与其发生过程。氧化应激反应以及促炎和细胞死亡途径的激活，都会诱导DCM 的发生，引起细胞因子过表达和巨噬细胞浸润诱导应激、纤维化、细胞凋亡和器官损伤。因此，抗炎和抗氧化药物可能有助于预防和治疗DCM。

Pic 是具有抗炎和抗氧化活性的天然多酚化合物。为了探讨Pic 对DCM 的治疗效果及机制，本课题通过体内外实验进行验证，首先我们验证Pic 对H9c2 大鼠心肌细胞活性影响和抗炎效果，结果显示，在HG 环境下，H9c2 细胞的活性有所抑制，而给予Pic 后，H9c2 的活性提高。此外主转录因子NFκB 调控HG 环境诱导的许多炎症因子编码基因的表达。HG 的刺激触发了IκBα 的磷酸化，由此产生的p65 从细胞质转移到细胞核，IκBα 随后在细胞质中降解。在细胞核中，NF-κB 激活编码分解代谢酶、炎症介质和细胞因子的表达[16]。本研究结果表明，在HG 条件下，NF-κB p65 核易位加速，p65 会定位于细胞核中，说明HG 条件激活了NF-κB，但给予Pic处理后可逆转，说明Pic 在H9c2 细胞中的抗炎作用可能是通过抑制NF-κB 的激活来介导的。

许多研究表明，在STZ 诱导的糖尿病模型[17-18]中存在心功能障碍。本研究首先通过心脏超声检查各组大鼠的心功能，大鼠腹腔注射STZ 建立Ⅰ型糖尿病模型后，能观察到大鼠心脏收缩及舒张功能受损，与Ⅰ型糖尿病患者DCM 的症状相似，目前多用此方法制备DCM 模型大鼠，从本研究结果可知，DCM 组大鼠的LVIDd 和LVFS 较正常组大鼠降低，而LVPW 升高，说明DCM 组大鼠的心功能较正常大鼠有所受损，此外，给予Pic 干预治疗的大鼠心功能较DCM 组大鼠有所改善。

TGF-β1 是心肌纤维化的关键因子，在DCM 心肌纤维化过程中处于过度表达状态[19]。从HE 染色结果得知，Pic 治疗能改善DCM 组大鼠心肌组织排列紊乱、心肌纤维断裂的情况。且从TGF-β1 免疫组化染色的结果可以看到，Pic 治疗后，TGF-β1 的表达较DCM 组降低，说明Pic 可通过下调TGF-β1 的表达来减少心肌纤维化。研究组还通过各组大鼠血糖水平和HW/BW 比值来检测Pic 的治疗作用，结果显示，Pic 治疗后的大鼠血糖和HW/BW 比值较DCM组大鼠下降，进一步证明Pic 可以预防与糖尿病相关的血糖水平的升高和心肌肥厚的发生。

氧化应激仍被认为是DCM 发病的核心机制之一[20-21]，而Pic 具有抗氧化的作用，有文献报道，Pic可以减轻糖尿病肾病大鼠氧化应激水平[22]，从研究结果可知，DCM 组大鼠心肌组织SOD 含量较正常组下降，同时MDA 含量升高，说明DCM 组大鼠心脏氧化应激水平提高[23]，而给予Pic 治疗后，氧化应激反应下降，同时，根据TUNEL 染色结果可知，Pic 治疗后的大鼠心肌细胞凋亡水平下降，该结果说明Pic 通过提高心肌组织中SOD 水平和降低MDA 水平，来降低心肌细胞的凋亡，从而减轻DCM 的症状。

综上，Pic 可能通过降低DCM 大鼠氧化应激水平、减少心肌纤维化、改善心肌组织排列以及降低心肌细胞凋亡来预防和治疗DCM。