菜豆菌核病病原菌的分离鉴定及防治药剂筛选

李孟华 刘大军 刘 畅 杨晓旭 闫志山 冯国军

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，黑龙江哈尔滨 150081）

菜豆（PhaseolusvulgarisL.）是豆科菜豆属重要的蔬菜作物，是人们日常饮食中蛋白质、纤维、热量和微量元素的重要来源之一。随着菜豆种植面积的增加，由真菌、病毒、细菌和线虫引起的200余种传染性病害成为了菜豆生产的主要限制因素（Assefa et al.，2019；Nay et al.，2019）。近年来由于菜豆种植规模扩大、连续重茬种植等原因，菌核病成为黑龙江省菜豆生产中的主要病害之一，露地种植和大棚种植均有发生。菌核病，又称白霉病（white mold disease），病原菌为核盘菌〔Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary〕，属于真菌界子囊菌门盘囊菌纲柔膜菌目核盘菌科核盘菌属。该菌寄主范围广，是一种世界性植物病原菌，可侵染豆科、茄科、十字花科等75 个科逾400 种植物，被认为是最具破坏性的植物病原菌之一（Boland & Hall，1994）。核盘菌以菌核的形式在土壤、植株残体或种子中越冬和越夏，当气候条件适宜时菌核萌发产生子囊盘，释放子囊孢子，随雨水或气流传播，或萌发为菌丝侵染植物（Young & Werner，2012）。植株受害部位出现水渍状菌丝，后期受害部位萎蔫、干枯并出现黑色菌核（Botelho et al.，2013；Howard &Shree，2013）。阿根廷大部分菜豆种植区都能检测到核盘菌，该菌引起的菌核病造成菜豆减产30%，在雨季发生此病害甚至会造成绝收（Singh &Schwartz，2010）。由核盘菌引起的油菜、甘蓝、茄子菌核病在国内造成的危害较为严重（吴兴泉 等，2006；李韦柳 等，2021；张华蕊 等，2022）。刘春艳等（2007）依据病原菌培养形状、形态特征等方法对天津地区保护地菜豆菌核病病原菌进行鉴定，但传统鉴定方法难以区分菌株之间的差别。近年来随着分子生物学的快速发展，病原菌的鉴定达到了分子水平，真菌核糖体基因转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）在遗传进化中因具有高度保守性，成为目前病原真菌种属分类鉴定的重要依据之一（陈凤毛，2007；Damm et al.，2012）。

为精准鉴定病原菌，有效防治菜豆菌核病，本试验对采集自黑龙江省哈尔滨市呼兰区、绥化市兰西县菜豆种植区的菜豆菌核病病样进行病原菌分离、纯化，并采用微生物学、分子生物学方法进行鉴定，测定其生物学特性，利用菌丝生长速率法测定11 种杀菌剂对核盘菌的抑制效果，以期为黑龙江省菜豆菌核病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病株：于2021 年7 月从黑龙江省哈尔滨市呼兰区、绥化市兰西县菜豆种植区采集已具有菌核病典型症状的病株，放入无菌牛皮纸袋并编号带回实验室进行分离。

供试菜豆品种：祥冠、黄冠、1927-1-2、1971-7-9，均由黑龙江大学园艺学团队提供。在人工气候箱温度28 ℃/18 ℃（昼/夜）、光照时间12 h/12 h（昼/夜，下同）、相对湿度60%条件下培养健康植株，供致病性检测。

供试培养基：察氏培养基，硝酸钠3 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL；马丁培养基，蛋白胨5.0 g、酵母浸出粉2.0 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾1.0 g、硫酸镁0.5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL；菜豆叶培养基，菜豆叶100 g 切碎，加水煮沸30 min，纱布过滤，加葡萄糖20 g、琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL；玉米粉培养基，玉米粉30 g、琼脂17 g、蒸馏水1 000 mL；麦芽汁培养基，麦芽汁150 mL、琼脂3 g、蒸馏水1 000 mL。

供试杀菌剂：50%腐霉利可湿性粉剂（日本住友化学株式会社）、40%菌核净可湿性粉剂（江西禾益化工股份有限公司）、50%啶酰菌胺水分散粒剂（巴斯夫欧洲公司）、30%噁霉灵水剂（江西禾益化工股份有限公司）、75%百菌清可湿性粉剂（江苏利民化学有限责任公司）、50%多菌灵可湿性粉剂（江苏三山农药有限公司）、25%吡唑醚菌酯悬浮剂（河北成悦化工有限公司）、30%肟菌酯 ·戊唑醇悬浮剂（浙江中山化工集团股份有限公司）、16%多抗霉素可溶粒剂（山东省乳山韩威生物科技有限公司）、300 g · L-1醚菌 · 啶酰菌悬浮剂（巴斯夫欧洲公司）、29%戊唑 · 嘧菌酯悬浮剂（安道麦马克西姆有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化与致病性测定 采用组织分离法分离病原菌。用无菌手术刀于病健交界处切取5 mm × 5 mm 的组织，先浸泡在75%乙醇中消毒30 s，无菌水冲洗3 次，再浸泡在1%次氯酸钠溶液中消毒30 s，无菌水冲洗3 次，置于无菌滤纸上吸收多余水分后接种于PDA 培养基上，25 ℃倒置培养。待菌丝生长后，挑取菌落边缘菌丝接种于新的PDA 培养基上，如此反复数次，直到分离出单菌落形态分离物（方中达，1998）。挑取纯化后的菌丝至PDA 斜面试管，于4 ℃保存备用。采用活体组织接种和柯赫氏法则验证从菜豆菌核病病株上分离得到的病原真菌致病性。选取生长21 d、第1 片三出复叶完全展开且长势一致的健康菜豆植株，分别在植株茎部和叶片接种直径5 mm 的菌饼，每个菜豆品种处理5 株，设3 次重复，以接种相同大小的无菌PDA 饼为对照，接种后置于人工气候箱中继续培养，观察并记录发病情况。

1.2.2 病原菌的形态学鉴定 将分离纯化菌株接种于PDA 培养基，25 ℃恒温培养，观察菌株的菌落颜色、形状、菌丝形态学指标和菌核产生情况。

1.2.3 病原菌的分子生物学鉴定及系统进化分析 将玻璃纸剪成直径为8.8 cm 的圆形，经高温高压湿热灭菌（121 ℃，20 min）2 次后，平铺到准备好的PDA 培养基上，吹干后接种分离物，封好后置于25 ℃恒温培养箱中。48～60 h 后，待菌丝刚长到培养基边缘时，用无菌镊子刮取菌丝，液氮速冻后采用改良CTAB 法提取分离物DNA（李焕宇 等，2017），利用ITS 通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增病原物的ITS 序列（卢文洁 等，2019）。PCR 扩增体系总体积为50 μL：2×TaqPCR Master Mix 25 μL、5 μmol · L-1引物ITS1/ITS4 各2 μL、DNA 模板2 μL、ddH2O 补足至50 μL。反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性35 s，54 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，共35 个循环；最后72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶对PCR 产物进行电泳检测（Alshahni et al.，2009），于凝胶成像系统中观察并记录电泳结果。PCR 产物由金唯智（苏州）生物科技有限公司测序后，对测序结果用BLAST 程序与GenBank数据库中已知序列进行比对和同源性分析，利用MEGA 7.0 软件构建基于rDNA-ITS 序列的系统发育树，Boot-strap replications 值设为1 000。

1.2.4 培养基对菌丝生长和菌核形成的影响 将供试菌株接种于PDA 培养基纯培养3 d 后，用灭菌打孔器沿菌落边缘内测打取直径为5 mm 的菌饼，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马丁培养基（MB）、菜豆叶培养基（LDA）、麦芽汁培养基（MEA）、玉米粉培养基（CMA）、察氏培养基（Czapek）上，在人工气候箱25 ℃黑暗条件下培养，每处理5 次重复，2 d 后使用十字交叉法测量菌落直径，20 d 后调查菌核数量，烘箱50 ℃烘干至菌核质量不再变化测定菌核干质量。

1.2.5 温度对菌丝生长和菌核形成的影响 将直径为5 mm 的菌饼接种于PDA 培养基中央，分别置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒温培养箱中黑暗条件下培养，每处理5 次重复，菌落直径、菌核数量、菌核干质量的测定方法同1.2.4。

1.2.6 pH 对菌丝生长和菌核形成的影响 用1 mol ·L-1HCl 和1 mol · L-1的NaOH 将PDA 溶液的pH调节至4、5、6、7、8、9、10，共7 个梯度。将直径为5 mm 的菌饼分别接种于不同pH 的PDA 培养基中央，在人工气候箱25 ℃黑暗条件下进行培养，每处理5 次重复，菌落直径、菌核数量、菌核干质量的测定方法同1.2.4。

1.2.7 光照对菌丝生长和菌核形成的影响 将直径为5 mm 的菌饼接种于PDA 培养基中央，分别置于光照时间为24 h 连续光照、12 h/12 h 光暗交替、24 h 连续黑暗的人工气候箱（25 ℃）中进行培养，每处理5 次重复，菌落直径、菌核数量、菌核干质量的测定方法同1.2.4。

1.2.8 碳、氮源对菌丝生长和菌核形成的影响 碳源：以Czapek 培养基作为基本培养基，分别用相同质量的可溶性淀粉、葡萄糖、甘露醇、木糖、麦芽糖、乳糖替换培养基中的蔗糖作为不同碳源。将直径为5 mm 的菌饼分别接种于不同碳源的Czapek培养基中央，在人工气候箱25 ℃黑暗条件下进行培养，每处理5 次重复，菌落直径、菌核数量、菌核干质量的测定方法同1.2.4。

氮源：以Czapek 培养基作为基本培养基，分别用相同质量的氯化铵、尿素、蛋白胨、牛肉膏、甲硫氨酸、硫酸铵、酵母粉、硝酸钾替换培养基中的硝酸钠作为不同氮源。将直径为5 mm 的菌饼分别接种于不同氮源的Czapek 培养基中央，在人工气候箱25 ℃黑暗条件下进行培养，每处理5 次重复，菌落直径、菌核数量、菌核干质量的测定方法同1.2.4。

1.2.9 杀菌剂筛选及其抑菌作用 选取11 种国内常用杀菌剂，采用菌丝生长速率法测定各药剂对菜豆核盘菌的抑制作用。用无菌水将供试药剂配成1 mg · mL-1母液（药剂换算成有效成分为100%），待PDA 培养基冷却至50 ℃时加入药剂母液，制成终浓度分别为0.05、0.25、1、2.50、5.00 μg · mL-1的含药培养基，以等量无菌水为空白对照。将直径为5 mm 的菌饼接种于含药的PDA 培养基中央，在人工气候箱25 ℃黑暗条件下进行培养，每处理3 次重复，3 d 后使用十字交叉法测量菌落直径，计算各药剂浓度对菌丝生长的抑菌率、毒力回归方程及EC50（肖宇峰 等，2022）。

抑菌率 = （对照菌落直径-处理菌落直径）/ 对照菌落直径× 100%

1.3 数据分析

利用SPSS 25 软件对试验数据进行统计分析，采用Duncan 氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 菜豆菌核病发病症状

菜豆菌核病主要危害菜豆植株中下部，全株均可感染发病。受害植株多从主茎基部分叉处开始发病，病斑呈褐色水渍状并沿主茎及分枝扩展，发病后植株茎基部出现深褐色腐烂且易造成植株倒折（图1-a）。湿度大时发病部位可见白色絮状菌丝，后期菌丝聚集部位出现黑色鼠粪状菌核（图1-b）。受害叶片多位于植株下部，叶片上亦出现褐色水渍状病斑，可沿叶柄蔓延至茎部（图1-c）。受害豆荚荚壁出现褐色水渍状病斑，腹缝线及背缝线处可见白色絮状菌丝，后期菌丝聚集部位出现黑色鼠粪状菌核（图1-d）。

2.2 病原菌的分离纯化与致病性测定

从菜豆病株分离纯化得到10 个菌株，菌落均为白色，菌株间形态特征一致，挑选代表菌株LMH-001 进行致病性检测。叶片接种菌株7 d 后出现褐色水渍状病斑，病斑表面可见白色菌丝（图2-a）；茎部接种7 d 后出现褐色水渍状病斑，发病部位表层腐烂（图2-b）。接种后发病症状与田间自然发病症状一致，对接种后发病部位进行病原菌再分离，均能获得与原分离菌株一致的病原菌。根据柯赫氏法则，确定菌株LMH-001 为菜豆菌核病的致病菌。

图2 菜豆植株接种菌株LMH-001 后的发病症状

2.3 菜豆菌核病病原菌的鉴定

2.3.1 病原菌形态学鉴定 病原菌在PDA 培养基上培养3 d 后菌落呈圆形，直径84～89 mm，菌丝为白色（图3-a）；6 d 后培养基边缘菌丝密集生长并聚集突起成团，菌丝聚集物前期为白色，随着体积膨大变为褐色，且表面有透明液滴出现（图3-b）；9 d 后菌丝聚集物褐色加深逐渐变为黑色，表面附着的透明液滴消失，形成粗糙干燥的菌核，菌核沿培养基边缘环形排列（图3-c）。显微镜下（200 倍）观察，菌丝无色透明、有隔（图3-d）；菌核切片外层为坚硬黑褐色外壳，内部为紧密白色菌丝聚集物（图3-e）。将菌核置于4 ℃黑暗条件下保湿培养35 d，再转入人工气候箱20 ℃黑暗条件下保湿培养，41 d 后菌核开始萌发（图3-f）。

图3 菌株LMH-001 的菌丝生长与菌核形成

2.3.2 病原菌的分子生物学鉴定及系统进化分析 利用引物ITS1 和ITS4 从菌株LMH-001 上扩增得到长度为512 bp 的片段（图4），将供试菌株ITS 序列与GenBank 中已有的序列进行BLAST 比对，结果显示，菌株LMH-001 的ITS 序列与S.sclerotiorum（GenBank 登录号MG640582.1）和S.sclerotiorum（GenBank 登录号KX276153.1）的同源性大于99%。系统发育树显示，菌株LMH-001与S.sclerotiorum聚在同一分支（图5）。结合各菌株形态学特征，将供试菌株鉴定为核盘菌（S.sclerotiorum）。

图4 供试菌株LMH-001 的ITS 序列PCR 扩增结果

图5 基于ITS 序列构建的菌株LMH-001 及其相关菌株的系统发育树

2.4 菜豆菌核病病原菌的生物学特性

2.4.1 培养基对菌丝生长和菌核形成的影响 由表1 可以看出，菌株LMH-001 在6 种培养基上均能生长并形成菌核，其中在MEA 培养基上菌丝生长速度最快，培养2 d 平均菌落直径5.51 cm，显著大于其他培养基；PDA 培养基次之；供试菌株在MEA、LDA、PDA 培养基培养6 d 后均形成菌核；MB 培养基培养20 d 后形成的菌核数量最多，显著多于其他培养基，但菌核干质量较小；PDA 培养基培养20 d 后产生的菌核干质量最大，平均每皿0.175 1 g。综合菌丝生长速度和菌核形成情况，供试病原菌的最适生长培养基为PDA。

表1 不同培养基对菜豆菌核病菌丝生长和菌核形成的影响

2.4.2 温度对菌丝生长和菌核形成的影响 由表2 可以看出，病原菌LMH-001 在5～35 ℃范围内菌丝均可生长，最适生长温度为20、25 ℃，培养2 d 菌落直径分别为5.42、5.40 cm，显著大于其他温度处理；温度为5、35 ℃时菌落直径显著低于10～30 ℃处理，菌丝生长受到明显抑制；0、40 ℃时菌丝停止生长。供试病原菌在10～30 ℃培养20 d 均可以形成菌核，菌核形成的最适温度为20、25℃，培养6 d 即可形成菌核，且平均每皿菌核数量（32.3、43.6 个）和菌核干质量（0.168 7、0.171 9 g）均显著高于其他温度处理。

表2 不同温度对菜豆菌核病菌丝生长和菌核形成的影响

2.4.3 pH 对菌丝生长和菌核形成的影响 由表3可以看出，病原菌LMH-001 在pH 4～10 范围内菌丝均可生长并形成菌核，当pH 为6 时，培养2 d菌落直径可达5.13 cm，显著大于其他处理；pH 为10 时菌落直径显著低于其他处理，菌丝生长受到明显抑制。供试病原菌在pH 为6 时培养6 d 形成菌核，培养20 d 时平均每皿菌核数量33.8 个，菌核干质量0.183 9 g。综合结果来看，菌丝生长与菌核形成的最适pH 为6。

表3 不同pH 对菜豆菌核病菌丝生长和菌核形成的影响

2.4.4 光照对菌丝生长和菌核形成的影响 由表4 可以看出，病原菌LMH-001 在24 h 连续光照、12 h/12 h 光暗交替、24 h 连续黑暗条件下菌丝均可生长且能形成菌核，不同光照处理对菌丝生长、菌核形成时间、菌核干质量无显著影响；24 h 连续光照下培养20 d 平均每皿菌核数量为36.2 个，显著高于其他处理。

表4 不同光照对菜豆菌核病菌丝生长和菌核形成的影响

2.4.5 碳源对菌丝生长和菌核形成的影响 由表5可以看出，病原菌LMH-001 在7 种碳源培养基上菌丝均能生长，对葡萄糖的利用效果最好，培养2 d 后平均菌落直径为4.97 cm，培养7 d 时形成菌核，20 d 时平均每皿菌核数量为33.2 个，每皿菌核干质量为0.142 8 g，均显著高于其他处理；对木糖的利用效果最差，培养2 d 后平均菌落直径为0.64 cm，显著低于其他处理，培养20 d 时未形成菌核。

表5 不同碳源对菜豆菌核病菌丝生长和菌核形成的影响

2.4.6 氮源对菌丝生长和菌核形成的影响 由表6可以看出，病原菌LMH-001 在9 种氮源培养基上菌丝均能生长；除尿素和硫酸铵氮源培养基外，其他7 种氮源处理均能在培养20 d 内形成菌核，其中对酵母粉的利用效果最好，培养2 d 后菌落直径为6.82 cm，6 d 时形成菌核，培养20 d 平均每皿菌核数量为53.2 个，每皿菌核干质量为0.248 9 g，显著高于其他氮源处理，其次为牛肉膏、蛋白胨；对尿素的利用效果最差，培养2 d 后平均菌落直径为0.73 cm，显著低于其他氮源处理，培养20 d 时未形成菌核。

表6 不同氮源对菜豆菌核病菌丝生长和菌核形成的影响

2.5 杀菌剂筛选及其抑菌作用

由表7 可以看出，11 种杀菌剂对病原菌LMH-001 有不同程度的抑制效果，EC50介于0.116 9～38.379 8 μg · L-1之间。其中肟菌酯 · 戊唑醇、戊唑 · 嘧菌酯、吡唑醚菌酯、菌核净4 种杀菌剂的EC50值较小，分别为0.116 9、0.203 0、0.203 2、0.205 0 μg · L-1，对菜豆核盘菌的抑制效果较好。

3 结论与讨论

核盘菌属（Sclerotinia）下的真菌是重要的植物病原菌（杨淼泠 等，2021），本试验通过微生物学及分子生物学鉴定，确定了采集自哈尔滨市呼兰区、绥化市兰西县的菜豆菌核病病株的致病菌为核盘菌（S.sclerotiorum）。基于核盘菌的近缘属种遗传距离分析，供试病原菌LMH-001 与其他属种存在显著的遗传距离，而且其ITS 序列与核盘菌的同源性大于99%，与本试验中的传统鉴定结果吻合，可以确定菌株LMH-001 为核盘菌。

本试验中，菜豆菌核病病原菌在PDA 平板上生长良好，与王玮等（2012）研究结果一致；利于菌丝生长和菌核形成的最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母粉，与刘春艳等（2007）研究结果不同；菌丝生长适宜温度为5～35 ℃，最适温度为20～25℃，产生菌核数量最多、干质量最大，与孙敬贤和张鲁刚（2015）、刘婷婷等（2016）的研究结果一致，这与菌核病在黑龙江初秋发生的温度湿度条件特点吻合，但与顾玉阳等（2020）对扁豆菌核病最适菌核产生温度的研究结果不同。在pH 4～10 的条件下，核盘菌菌丝均能生长和产生菌核，表明该菌能够适应不同的pH 环境，这可能与其在生长过程中分泌草酸和多种酶类等物质有关（Xu et al.，2015；Tian et al.，2021）；菌丝生长和菌核形成的最适pH为6，与刘志恒等（2013）研究结果一致。随着pH值的增加，核盘菌菌核形成的数量减少，与唐仕娟等（2021）对向日葵菌核病病原菌的研究结果不同，该菌在pH 值为10 时仍能产生菌核。核盘菌在逆境条件下，温度较低时形成的菌核数量较少，平均单个菌核干质量较大，温度较高时平均单个菌核干质量较小；pH 值较高时产生的菌核数量较少，平均单个菌核干质量较大，pH 值较低时平均单个菌核干质量较小。但关于其形成机理尚不明确。核盘菌产生的菌核对逆境具有很强的适应能力，菌核萌发后产生的菌丝和子囊孢子有利于该病害的传播，因此菌核在核盘菌的生命周期和病害循环中都具有重要作用（Liang et al.，2018）。本试验对供试病原的生物学特性测定表明，核盘菌利用碳、氮源范围较广，对温度、pH 适应能力强，光照对菌丝生长与菌核形成无显著影响，这与石凤梅等（2013）研究结果一致。

随着黑龙江各地的菜豆种植面积逐年增加，菜豆菌核病危害趋势越发严重，目前对菜豆菌核病的防治仍以化学防治为主。本试验通过对农药有效成分的杀菌效果进行筛选，30%噁霉灵水剂中的有效成分hymexazol 和300 g · L-1醚菌 · 啶酰菌悬浮剂中有效成分Boscalid 均对菌核病有较好的防治作用，可以为菌核病的防治提供更多用药选择。11 种杀菌剂的室内药剂筛选结果表明，肟菌酯 · 戊唑醇对菌丝生长的抑制效果最好，EC50值为0.116 9 μg ·L-1，其次为戊唑 · 嘧菌酯、吡唑醚菌酯、菌核净，EC50值均≤0.205 0 μg · L-1。因此，可将肟菌酯 ·戊唑醇作为防治菜豆菌核病的首选药剂，4 种杀菌剂交替使用，避免产生抗药性（李永刚和陈丽娜，2011）。控制菌核病的发生需要通过化学防治、生物防治、农业防治（如轮作）和选育抗病品种等方式建立综合的防治方案（Smolinska & Kowalska，2018）。对于黑龙江省菜豆菌核病，建议加强田间管理，在初秋病害发生前期提前预防，减少侵染源。由于本试验仅于实验室条件下进行，还需要开展田间试验测定大田环境对菜豆核盘菌的影响，以期在菜豆生产中少量高效用药，降低用药成本，减少农药残留。