罗哌卡因基于AKT/mTOR信号通路对创伤性脑损伤大鼠认知损害的保护作用

毛蕾 兰志勋 马德祥 游霁月

(四川省医学科学院 四川省人民医院麻醉科,四川 成都 610072)

创伤性脑损伤是神经系统较为严重的疾病,是由外力引起创伤性结构损伤,常伴有头皮损伤、颅骨骨折、脑脊漏液等〔1,2〕。该疾病主要表现为头晕、恶心、记忆力障碍,严重可出现意识障碍,甚至导致死亡〔3,4〕。据流行病学调查显示,随着社会的发展、出行方式的转变,创伤性脑损伤发生率升高趋势更为显著〔5〕。罗哌卡因是一种氨酰类局麻药物,可抑制钠离子通道,阻断神经传导与兴奋〔6〕。本文分析罗哌卡因对创伤性脑损伤模型大鼠蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响,旨在探讨罗哌卡因是否通过AKT/mTOR信号通路干预创伤性脑损伤的认知保护。

1 材料与方法

1.1材料 选取40只雄性大鼠(华兰生物疫苗有限公司,使用许可证号:SYXK(豫)2017-0002,鼠龄3～5个月,平均年龄(4.0±0.8)个月;体质量258～279 g,平均(268.5±8.4)g。在相对湿度40%～65%、温度(22.5±2.1)℃的环境中适应性喂养1 w。本研究严格按照动物实验伦理要求操作,且通过医院伦理委员会审批同意。主要试剂:小鼠抗兔白细胞介素(IL)-1β抗体(Invitrogen公司)、小鼠抗大鼠IL-6抗体(Hyclone公司)、兔抗大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(Selleck公司)、兔抗小鼠超氧化物歧化酶(SOD)抗体(BD公司)、大鼠抗小鼠丙二醛(MDA)抗体(Sigma公司)、大鼠抗兔AKT、mTOR抗体(Gibco公司)。

1.2建模及分组 随机挑选10只大鼠为正常组,不做任何处理。其余30只建立创伤性脑损伤模型:大鼠禁食12 h,麻醉,固定于外伤模型装备架,头部去毛后消毒,切开头皮,暴露颅骨,颅骨打磨器开直径5 mm骨孔,使用撞击器撞击颅骨位置,撞击参数:撞击深度2 mm,速度4 m/s,撞击时间120 ms,完成后将切口缝合,撞击过程中3只大鼠死亡,最终27只大鼠建模成功,随机分为脑损伤组13只,罗哌卡因组14只,建模完成后1 h罗哌卡因组尾静脉注射罗哌卡因6 mg,正常组、脑损伤组不做处理。

1.3大鼠认知功能检测 逃避潜伏期:各组进行水迷宫实验,水迷宫为圆形水池,直径110 cm、高60 cm、水深40 cm,水温25 ℃,安全平台随机放置于任一象限中央位置,平台直径10 cm,水面高于平台2 cm,大鼠训练后随机选择入水点,观察并记录大鼠爬上平台所需时间。60 s穿越平台次数:各组连续训练1 w后,撤除平台,放入任一入水点,记录60 s穿越平台次数。

1.4脑含水量测定 造模完成后3 d处死大鼠,快速取脑组织,测量并记录脑组织湿重,烘箱中烘干,迅速测量其干重,脑组织含水量:脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.5HE染色 甲醛溶液固定脑组织24 h,石蜡包埋,流水冲洗,不同浓度酒精脱水,二甲苯透明,切片,厚度约6 μm,脱蜡,过氧化氢溶液孵育10 min,流水冲洗,苏木素染色5 min,氨水分色5 s,流水冲洗,70%、90%酒精各脱水10 min,伊红染色3 min,纯酒精脱水,二甲苯透明,树胶封片,显微镜(上海巴拓仪器有限公司,型号:BMM-580DIC)下观察。

1.6酶联免疫吸附试验检测炎症因子、氧化应激水平 各组麻醉后,腹主动脉取血,3 000 r/min离心15 min,离心半径10 cm,分离血清-20 ℃保存。稀释待测血清,每孔加稀释后的待测血清200 μl,37 ℃静置2 h,磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡,洗涤,甩干,每孔加稀释含抗原的被检标本,37 ℃静置1 h,洗涤,每孔加底物液,室温静置30 min,每孔加终止液,酶标仪(上海科华生物工程有限公司,型号:ST-360)测定IL-1β、TNF-α、IL-6、SOD、MDA水平。

1.7Western印迹法检测AKT/mTOR通路蛋白表达 细胞裂解液将样品裂解,测定样品蛋白浓度,加适量浓缩十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),水浴4 min,充分变性蛋白,冷却,电泳,转模,漂洗,加封闭液,室温封闭60 min,加一抗,4 ℃孵育1 h,回收一抗,洗涤,加二抗,4 ℃孵育1 h,回收二抗,洗涤,超敏电化学发光(ECL)液(广州进德生物科技有限公司)检测AKT、mTOR蛋白表达。

1.8统计学处理 采用SPSS26.0软件行F、t检验。

2 结 果

2.1各组大脑皮层组织病理学观察 正常组大脑皮层组织细胞排列规则有序、细胞结构清晰完整,细胞间无水肿现象;脑损伤组组织疏松、细胞排列不规则,细胞间水肿、炎症浸润明显;罗哌卡因组细胞排列较规则,结构较清晰完整,细胞间水肿、炎症浸润明显改善。见图1。

图1 各组大脑皮层组织病理学(HE,×100)

2.2各组脑含水量比较 与正常组比较,脑损伤组、罗哌卡因组脑含水量显著增加(P<0.05);与脑损伤组比较,罗哌卡因组脑含水量显著减少(P<0.05)。见表1。

表1 各组脑含水量、逃避潜伏期、穿越平台次数、炎症因子水平、氧化应激水平比较

2.3各组认知功能比较 与正常组比较,脑损伤组、罗哌卡因组逃避潜伏期时间较长,穿越平台次数较少,差异有统计学意义(P<0.05);与脑损伤组比较,罗哌卡因组逃避潜伏期时间较短,穿越平台次数较多,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4各组炎症因子水平比较 与正常组比较,脑损伤组、罗哌卡因组IL-1β、TNF-α、IL-6水平较高;与脑损伤组比较,罗哌卡因组上述指标水平较低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.5各组氧化应激水平对比 与正常组比较,脑损伤组、罗哌卡因组SOD水平较低,MDA水平较高;与脑损伤组比较,罗哌卡因组SOD水平较高,MDA水平较低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.6各组AKT/mTOR通路蛋白相对表达量对比 与正常组比较,脑损伤组、罗哌卡因组AKT、mTOR表达较低;与脑损伤组比较,罗哌卡因组AKT、mTOR表达较高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组AKT/mTOR通路蛋白相对表达量对比

图2 3组AKT、mTOR通路蛋白表达

3 讨 论

创伤性脑损伤根据发病类型分为原发性、继发性脑损伤,原发性损伤一系列反应可引起严重继发性反应,导致脑水肿、颅内压升高、脑组织灌注不足,神经细胞死亡、神经功能损害〔7,8〕。该疾病的发生机制主要与初期炎症反应相关,特点是可激活免疫活性,释放炎性介质〔9,10〕。有研究显示,全球意外伤害中创伤性脑损伤的死亡和伤残率居首位,给经济和社会带来较大负担,因此,了解疾病病理、寻找治疗方法有重要价值〔11〕。

脑含水量是判定脑损伤修复的指标,创伤性脑损伤大鼠模型脑部含水量越低,表明脑组织修复状况越好〔12〕。逃避潜伏期时间、穿越平台次数用于评价大鼠认知功能改善,大鼠承逃避潜伏期时间越短、穿越平台次数越多,说明认知功能恢复情况越好〔13〕。本研究表明,罗哌卡因能有效改善脑损伤大鼠认知功能,改善脑含水量,从而减轻脑组织损伤。

罗哌卡因是一种新型纯左旋长效局麻药,具有麻醉、镇痛双重效应〔14〕。有研究表示,罗哌卡因可调节创伤性脑损伤大鼠IL-1β、TNF-α等炎症因子水平,罗哌卡因可抑制TNF-α、IL等分泌,有研究证明IL-1β、TNF-α可介导内毒素损伤效应,放大炎症过程,加重脑水肿,IL-1β、TNF-α水平下降,可减少脑组织损伤,从而促进对脑组织的修复〔15〕。据相关研究显示,罗哌卡因可调控SOD、MDA等氧化应激因子水平,改善机体抗氧化能力,从而保护脑组织细胞,促进脑部功能修复〔16〕。本研究结果显示,经罗哌卡因处理后,创伤性脑损伤大鼠炎症因子水平下降,抗氧化功能提升,从而减轻脑组织创伤,进而抑制脑组织进一步损伤,促进创伤性脑损伤的修复。

AKT/mTOR信号通路是一种重要的信号转导途径,可影响转录蛋白的合成,在细胞生长、增殖、血管形成中发挥重要生物学功能〔17〕。AKT是PI3K重要的下游分子,可调控细胞的生长、存活、增殖;mTOR是一类高度保守的丝/苏氨酸激酶,在离子转运、细胞存活、蛋白细胞骨架形成中有重要作用〔18,19〕。相关研究显示,使用罗哌卡因干预的创伤性脑损伤大鼠,其AKT、mTOR等蛋白表达降低,可能是罗哌卡因能抑制AKT/mTOR信号通路活性,促进脑组织细胞的增殖、发育,从而促进创伤性脑损伤大鼠的脑组织修复〔20,21〕。本研究结果认为,AKT/mTOR信号通路与罗哌卡因修复创伤性脑损伤大鼠的脑组织相关,经罗哌卡因干预后由AKT/mTOR介导的信号通路被抑制,AKT/mTOR信号通路可能抑制AKT、mTOR等通路蛋白活性,有效阻止脑细胞的程序性凋亡,从而保护脑组织细胞。