紫草素通过调控miR-214表达抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭

吴明媛 赵伟 赵远 毋亚坤 张瀚文

(焦作市人民医院,河南 焦作 454000)

宫颈癌主要指发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤。一般采用化疗、放疗治疗宫颈癌,但是效果较差,预后不良〔1,2〕。早期宫颈癌常无明显症状和体征,宫颈可光滑或难与宫颈柱状上皮异位区别。晚期症状根据癌灶累及范围出现不同的继发性症状。如尿频、尿急、便秘、下肢肿痛等;癌肿压迫或累及输尿管时,可引起输尿管梗阻、肾盂积水及尿毒症;晚期可有贫血、恶病质等全身衰竭症状〔3,4〕。紫草素具有抗癌、抗炎、抗菌等作用,临床也可以用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化〔5,6〕。紫草素可以抑制肿瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡,但其分子机制尚不是很明白〔7〕。本实验主要探究紫草素对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭及其miR-214表达的影响。

1 材料与方法

1.1药物 紫草素购自中国食品药品检定研究院,纯度>99%。

1.2实验动物 20只6周龄雌性 BALB/c 裸鼠(每组n=5)购自河南实验动物中心(中国郑州)。

1.3材料 宫颈癌细胞株Hela(中国科学院上海细胞库);胎牛血清(FBS)、DMEM培养基(美国Hyclone公司,批号NXA0544、NZE1147);胰蛋白酶(美国Sigma公司,批号2242B80);MTT试剂(美国Sigma公司,批号1313B12);Transwell小室(美国Corning公司,批20130204)。

1.4仪器 Q5实时定量PCR扩增仪(美国Cell Signaling公司);PTC-200型热循环仪(美国Bio-Rad公司);5415D型离心机(德国Eppendorf公司);F-4500型荧光定量检测仪(日本HITACHI公司)。

1.5药物处理 使用二甲基亚砜(DMSO)溶解紫草素,并使DMSO的终质量浓度小于0.01 g/L,-20 ℃避光保存。

1.6细胞培养与分组 宫颈癌细胞Hela用含10% FBS的DMEM培养基培养,待细胞生长至80%融合度时,用0.25%胰蛋白酶消化,取对数生长期细胞进行实验。用不同浓度(4、8、16、32、64 μmol/L)的紫草素处理Hela细胞,记为4 μmol/L组、8 μmol/L组、16 μmol/L组、32 μmol/L组、64 μmol/L组;正常培养的细胞作为对照(Con)组。将miR-NC、miR-214转染至Hela细胞,记为miR-NC组、miR-214组;将anti-miR-NC、anti-miR-214转染至Hela细胞,再用64 μmol/L紫草素处理,记为紫草素+anti-miR-NC组、紫草素+anti-miR-214组。

1.7MTT检测细胞增殖 细胞培养24 h,每孔加入20 μl MTT溶液,4 h后,加入150 μl/孔 DMSO溶液,反应10 min,把酶标仪的波长设置为490 nm,检测各孔的吸光度(OD)值。

1.8平板克隆形成实验检测细胞增殖 取细胞1×103个/孔接种于6孔板,直至出现肉眼可见的克隆,终止培养,加入4%多聚甲醛固定15 min,分别加入结晶紫染液染色5 min,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,观察克隆形成数。

1.9Transwell实验检测细胞迁移和侵袭 细胞侵袭实验:将基质胶加入小室的上室,孵育5 h,随后加入各组细胞(3×104个/孔),在小室的下室加入含有PBS的培养液(600 μl/室),继续培养24 h,多聚甲醛固定20 min,0.1%结晶紫染液染色10 min,计算侵袭细胞数。细胞迁移实验:基质胶不加入小室的上室,其他操作方法与侵袭实验一样。

1.10qPCR检测miR-214表达 TRIzol试剂提取细胞中总RNA,使用cDNA试剂盒逆转录成cDNA,实时荧光定量试剂盒进行荧光定量。miR-214:上游引物 5′-CACTCTATATAGTGTATCTTTC-3′,下游5′-GGCTTTTAGTGTACGTCGTAATG-3′;U6 上游引物 5′-ACGTCACGAGCCGTCTCTCGTGA-3′,下游 5′-GG-CTCCAACGTACCGATCAGTA-3′。使采用2-ΔΔCt方法分析miR-214表达水平。

1.11Western印迹检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达 提取细胞总蛋白质,用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测量蛋白质浓度。15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,并将其转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。室温条件下,将膜在5%脱脂乳中封闭2 h,然后,将膜与抗MMP-2(1∶1 000稀释液)、MMP-9(1∶1 000稀释液)、β-actin(1∶1 000稀释液)的一抗在4 ℃孵育过夜。次日,将膜与二抗(1∶2 000稀释度)在室温下孵育2 h。分析各条带灰度值。

1.12肿瘤异种移植 裸鼠实验经医院动物研究委员会批准。将各组处理过后的细胞(1×107个)皮下注射到 BALB/c 裸鼠中。每7天用卡尺测量肿瘤体积。注射35 d后处死所有小鼠,从所有裸鼠中分离肿瘤标本用于进一步分析。

1.13统计学分析 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1紫草素对宫颈癌Hela细胞增殖的影响 与Con组比较,8、16、32、64 μmol/L紫草素显著降低细胞OD值和克隆形成数,且呈剂量依赖性(P<0.05)。以64 μmol/L紫草素进行后续试验。见表1。

表1 紫草素对宫颈癌Hela细胞增殖的影响

2.2紫草素对宫颈癌Hela细胞迁移和侵袭的影响 与Con组比较,紫草素显著降低细胞迁移、侵袭数及MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05)。见表2、图1、图2。

1～6:Con组、紫草素组、miR-NC组、miR-214组、紫草素+anti-miR-NC组、紫草素+anti-miR-214组图1 Western印迹检测各组MMP-2、MMP-9蛋白

图2 Transwell检测各组细胞的迁移和侵袭(结晶紫染色,×200)

表2 紫草素对宫颈癌Hela细胞miR-214表达及迁移和侵袭的影响

2.3紫草素对宫颈癌Hela细胞中miR-214表达的影响 与Con组比较,紫草素显著升高miR-214表达水平(P<0.05)。见表2。

2.4miR-214过表达对宫颈癌Hela细胞增殖的影响 与miR-NC组比较,miR-214组miR-214表达水平显著升高(P<0.05),OD值和克隆形成数显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 miR-214过表达对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移、侵袭的影响

2.5miR-214过表达对宫颈癌Hela细胞迁移和侵袭的影响 与miR-NC组比较,miR-214组miR-214表达水平显著升高(P<0.05),细胞迁移、侵袭数及MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图1、图2、表3。

2.6抑制miR-214表达逆转了紫草素对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移和侵袭的影响 与紫草素+anti-miR-NC组比较,紫草素+anti-miR-214组miR-214表达水平显著降低(P<0.05),OD值和克隆形成数显著升高(P<0.05),细胞迁移、侵袭数及MMP-2、MMP-9蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图1、图2、表4。

表4 抑制miR-214表达逆转了紫草素对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.7紫草素对宫颈癌Hela细胞体外移植瘤的影响 与Con组〔(1 002.00±4.16)/mm3〕比较,紫草素组肿瘤体积〔(586.67±3.48)/mm3〕显著减小(P<0.05);与紫草素+anti-miR-NC组〔(580.00±4.73)/mm3〕比较,紫草素+anti-miR-214组肿瘤体积〔(839.67±2.33)mm3〕显著变大(n=5,P<0.001)。见图3。

1～4:Con组、紫草素组、紫草素+anti-miR-NC组、紫草素+anti-miR-214组图3 各组35 d时Hela细胞体外移植瘤

3 讨 论

紫草素来源于紫草科植物紫草的根。紫草素通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路可以抑制皮肤鳞状细胞癌细胞生长〔8〕。紫草素可以促进含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-9活化从而诱导大肠癌细胞凋亡〔9〕。二甲双胍和紫草素可以抑制人鼻咽癌细胞CNE-2Z增殖并促进凋亡〔10〕。紫杉醇联合紫草素对U87脑胶质瘤细胞有较好的抑制效果〔11〕。本实验研究表明,紫草素显著降低宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭数,对治疗宫颈癌有较好的疗效。Dan等〔12〕研究表明,β-羟基异戊基紫草素通过PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号传导诱导人宫颈癌细胞凋亡。Wang等〔13〕研究表明,紫草素通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡和自噬。郝臻凤〔14〕研究表明,紫草素通过调节小脑变性相关蛋白1反义转录物(ciRS-7)/miR-7/局部黏着斑激酶(FAK)轴抑制宫颈癌侵袭和迁移。杨阳等〔15〕研究表明,紫草素影响宫颈癌SiHa细胞增殖周期。于海荣等〔16〕研究表明,紫草素可以抑制人宫颈癌Hela细胞增殖。miR-214是一种非编码小RNA,已有研究发现,miR-214在多种肿瘤和癌症中有表达,并促进或抑制了肿瘤和癌症的发生发展。miR-214在甲状腺乳头状癌患者的血清中高表达,促进了其增殖〔17〕。miR-214与肿瘤的关系密切〔18〕。miR-214通过靶向β-catenin通路抑制肝癌生长〔19〕。本实验研究发现,miR-214在宫颈癌中高表达可以抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。已有研究宫颈癌的分子机制说明,miR-214对宫颈癌HeLa细胞恶性表型的影响,可以抑制宫颈癌的生长〔20〕。miR-214通过靶定GALNT7抑制宫颈癌细胞的生长和侵袭〔21〕。

本实验研究结果说明,紫草素可以通过上调miR-214表达抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。有类似的报道,β-羟基异戊酰紫草素通过干预miR-10a-5p影响非小细胞肺癌的发生发展〔22〕。本实验研究结果说明,紫草素可以通过上调miR-214表达减小肿瘤体积。有研究显示紫草素干预miR-130a-5p调节轴抑制乳腺癌侵袭迁移〔23〕。