河西走廊玉米大斑病菌0号生理小种生物学特性研究

雷玉明，郑天翔，邢会琴，程红玉，赵文勤，赵文明

1.河西学院农业与生态工程学院，甘肃 张掖 734000 2.甘肃河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000 3.河西学院祁连山有害生物综合治理中心，甘肃 张掖 734000 4.德光农业科技开发有限责任公司，甘肃 张掖 734000

玉米大斑病是由大斑凸脐蠕孢菌[Exserohilumturcicum(Pass.)LeonardetSuggs.]引起的一种威胁玉米生产的重要叶部病害。1876年在意大利首次发现，已遍布世界五大洲的所有玉米产区[1]。我国最早在1899年就有大斑病发生的记载，后遍及全国，以东北、西北、华北北部、南方冷凉山区的玉米产区发生较重[2]。20世纪80年代，由于引进高抗大斑病自交系Mo17，培育和推广抗大斑病的杂交种，有效控制了田间大斑病的发生[3]。近几年来，我国玉米种植区大斑病连年普遍发生，黄淮海、西北、东北等地大面积推行秸秆还田造成大斑病菌源积累量增大，东北、华北主栽品种抗病性普遍较差，2021年大斑病在东北、华北、西南、西北等大部分地区中等发生，局部偏重发生，发生面积达433 hm2[4]。王春明等[5]报道97份玉米杂交种对大斑病菌抗性鉴定，发现46.39%品种为感病和高感品种，病情分级达5～9级；孙瑞东等[6]对185份玉米种质抗大斑病菌分析，发现41.08%材料病斑面积在28%～96%之间，表现为感病和高感材料。雷玉明等[7-8]报道甘肃河西走廊玉米制种田真菌性病害达46种，其中大斑病发病率达48.63%，因受土地连作及抗病性差的亲本组合大面积单一种植、病原菌越冬基数增多、病原种群变化大、病原传播途径多等因素的影响，玉米大斑病呈逐年加重趋势，成为严重威胁玉米种子生产的主要病害。目前马周杰等[9]、戴冬青等[10]报道辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古、甘肃、宁夏、河北、山西、陕西、河南、山东、安徽等12个省份大斑病菌生理小种与交配型及遗传多样性，郭建国等[11]明确了甘肃河西走廊大斑病菌以0号为优势生理小种。但对甘肃独特地理环境和气候条件下的玉米大斑病的研究报道较少，特别是对其生物学特性尚未见系统研究。因此，以甘肃河西走廊玉米制种田大斑病为研究对象，系统研究大斑病菌的生物学特性，分析环境因子对病菌菌丝生长、产孢、孢子萌发的影响，可为河西走廊玉米大斑病的流行规律探讨和病害的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

玉米大斑凸脐孺孢病菌0号生理小种由河西学院农业与生态工程学院植物病理实验室提供。将纯化菌株接种于PSA平板，25 ℃恒温扩大培养6～7 d，制作成活化菌株平板，用于采集菌饼和配制孢子悬浮液。用10 mL无菌水将培养6～7 d菌株平板孢子洗下，配成1×106～1×107的孢子悬浮液备用。

1.2 不同温度对病菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

采用PSA培养基，用直径7 mm打孔器从菌落边缘取圆形菌块，置于PSA平板中央，设置5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃共9个温度梯度，每处理重复3次。7 d后用十字交叉法测量菌落直径，利用纽鲍尔(Neubauer)血球计数板测定产孢量[12]。孢子萌发测定的温度设置同前，吸取悬浮液1 mL采用凹玻片萌发法，重复3次，24 h后以孢子芽管长度大于1/2孢子宽度时视为萌发，测定孢子萌发率。

1.3 不同pH对病菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

pH设3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0共计9个梯度(用0.1%HCl和NaOH调节)。25 ℃恒温培养，分别测定病菌菌落直径和产孢量、孢子萌发率[12]。

1.4 不同光照对病菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

设24 h/d全光照、12 h/d光照+12 h/d黑暗的半光半暗、24 h/d全黑暗3种光照处理[12]。

1.5 7种碳源对病菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

以PSA为基础培养基，分别将蔗糖等量替换为葡萄糖、果糖、木糖、麦芽糖、乳糖、淀粉，以不加碳源为对照(CK)[12]。病菌菌落直径和产孢量测定方法与1.2相同。孢子萌发试验，将供试碳源按照2%浓度配制成培养液，分别吸取孢子悬浮液0.5 mL与2%碳源培养液0.5 mL等量混合，采用凹玻片萌发法，无菌水为对照(CK)，25 ℃恒温保湿培养。重复3次，24 h后测定孢子萌发率[13]。

1.6 7种氮源对病菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

以PSA为基础培养基，分别以0.5%的量加入硝酸钾、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、硫酸铵、氯化铵[12]，以不加氮源为对照(CK)，测定病菌的菌落直径和产孢量。孢子萌发的试验方法与1.5相同[13]。

1.7 菌丝致死温度测定

将直径7 mm的菌饼置于装有无菌水的试管中，每管10块，将试管分别置于45～60 ℃(温差1 ℃)的恒温水浴锅中，共计16个温度梯度，处理10 min(预热1 min左右)，迅速冷却后移植于PSA平板培养基，每皿3块，25 ℃恒温培养，每处理3次重复。7 d后观察菌丝生长状况，以无菌丝生长视为死亡，确定菌丝致死温度[13]。

1.8 分生孢子致死温度测定

取5 mL孢子悬浮液装入无菌试管中，将试管分别置于45～60 ℃(梯度间隔为1 ℃)恒温水浴锅中处理10 min(预热1 min左右)，12 h后测定孢子萌发率[13]。

1.9 数据处理

采用DPS 12.5数据处理系统Duncan’s新复极差测验法进行差异显著性分析。孢子萌发率计算公式：孢子萌发率=(萌发的孢子数/试验的孢子总数)×100%[8,13]。

2 结果与分析

2.1 温度对病菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

测定结果(见图1)表明，病菌菌丝生长、分生孢子产孢、孢子萌发的温度范围较广，在5～40 ℃时均可生长，生长速度差异显著。在28 ℃时生长最快，菌落平均直径达84.4 mm/7 d；其次为25、30 ℃，菌落平均直径分别达75.23 mm/7 d和75.33 mm/7 d；温度低于10 ℃和高于35 ℃生长缓慢，表明该菌菌丝生长的适宜温度为25～30 ℃。病菌在15～40 ℃间均可产孢，产孢量差异显著。28 ℃时产孢量最大，达8.67×104个/mL，温度低于15 ℃和高于40 ℃产孢量显著下降，表明低温或高温环境抑制产孢。分生孢子萌发对温度的要求范围较广，在5～40 ℃时均可萌发。25 ℃时孢子萌发率最高，达92.33%；其次为28 ℃，萌发率达85.33%；温度≥30 ℃或≤20 ℃均抑制孢子萌发，表明该菌分生孢子萌发最适温度为25～28 ℃(见图2)。

2.2 pH对病菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

试验结果(见图3)表明，病菌菌丝生长的pH适应范围广泛，在pH 3～11范围均能生长，生长速度差异显著。最适pH为7和8，生长速度最快，菌落平均直径分别达77.33 mm/7 d和77.87 mm/7 d；pH 3～5和pH 10～11菌丝虽能正常生长，但生长缓慢。pH 3～11范围均能产孢，但产孢差异显著，pH 7时病菌产孢量最高，达7.03×105个/mL；其次是pH 8，达6.93×105个/mL；pH 3～6和pH 9～11虽能产孢，但产孢量显著下降，表明pH 7～8是适宜的产孢范围。分生孢子在pH 3～11均能萌发，pH 7时萌发率最高，达80.67%；其次为pH 6和pH 8，分别达70.67%和70.33%；pH 3～5和pH 9～11分生孢子虽能萌发，但萌发率显著降低，表明分生孢子萌发适宜pH为6～8(见图4)。

2.3 光照对病菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

试验结果表明，不同光照条件下菌丝生长差异显著，12 h/d光照+12 h/d黑暗的半光半暗生长最快，菌落直径达63.33 mm，全黑暗条件下生长速度居中，全光照条件生长最慢。在不同光照处理下产孢量差异显著，半光半暗、全黑暗条件下产孢量较大，分别达7.67×104个/mL、6.67×104个/mL，全光照条件下产孢量较少。分生孢子在3种光照处理下均能萌发，差异显著，半光半暗、全黑暗条件下萌发率较高，分别达91.67%、91.00%，全光照条件萌发率最差。

2.4 碳源对病菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

从测定结果(见图5)可见，病菌对供试7种碳源的利用情况存在差异。菌丝在葡萄糖和木糖为碳源培养基中生长最好，菌落平均直径分别达65.40 mm/7 d和64.47 mm/7 d；其次为果糖和蔗糖，菌落平均直径分别达57.37 mm/7 d和57.60 mm/7 d；淀粉培养基中菌丝生长缓慢。从产孢量看，以果糖和乳糖、木糖为碳源培养基中产孢量最多，达6.67×104个/mL、6.00×104个/mL，其次为蔗糖，在淀粉培养基中产孢量与对照无差异。从对分生孢子萌发影响看，在葡萄糖溶液中萌发率最高，为80.60%；其次在木糖、果糖、蔗糖、麦芽糖溶液中萌发良好，对分生孢子萌发具有促进作用；而乳糖和淀粉溶液中萌发率低于无菌水对照，可见乳糖和淀粉抑制分生孢子萌发(见图6)。

2.5 氮源对病菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响

从测定结果(见图7)可见，病菌对氮源的利用表现明显差异。其中甘氨酸最适合菌丝生长，菌落平均直径达75.73 mm/7 d；在以酵母膏和蛋白胨为氮源的培养基上生长良好，分别达59.83 mm/7 d、60.10 mm/7 d；而以硝酸钾、牛肉膏、硫酸铵、氯化铵等为氮源的培养基上菌丝生长较差，生长量明显低于不加氮源对照，说明这4种氮源抑制菌丝生长。从产孢量看，供试7种氮源的培养基中产孢量较不加氮源对照的明显减少，说明氮源对分生孢子产生具有抑制作用。从对分生孢子萌发影响看，在蛋白胨溶液中萌发率最高，为87.30%；其次是牛肉膏、甘氨酸，萌发率为77.50%～78.80%，显著高于无菌水对照萌发率；而在硝酸钾、酵母膏、硫酸铵、氯化铵溶液中分生孢子萌发率显著低于无菌水对照，说明对分生孢子萌发有抑制作用(见图8)。

2.6 菌丝和分生孢子的致死温度

测定结果表明，在温度≥55 ℃时，未见菌丝生长，确定菌丝致死温度为55 ℃，10 min。当温度≥57 ℃时，分生孢子均不萌发，确定病菌分生孢子致死温度为57 ℃，10 min。

3 结论与讨论

本研究结果表明，河西走廊病菌生长的温度范围广泛，在5～40 ℃范围内菌丝和分生孢子均生长萌发，15～40 ℃范围内可产孢。菌丝生长的适宜温度为25～30 ℃，菌丝和产孢最适温度28 ℃，病菌在15～40 ℃间均可产孢，分生孢子萌发最适宜为25～28 ℃，25 ℃萌发率最高，菌丝致死温度为55 ℃，分生孢子的致死温度57 ℃。浦子钢[14]报道黑龙江西部地区的玉米大斑病菌菌丝生长的最适温度为20～30 ℃，上限温度达35 ℃，菌丝生长速度为0，30 ℃孢子萌发率最高。张治家等[15]报道山西省侯马地区玉米大斑菌株菌丝生长温度范围10～30 ℃，阳曲、静乐、屯留岭等地区菌株15～30 ℃，最适温度为25 ℃，10、40 ℃菌丝仍然生长。冯胜泽等[16]研究表明，大斑病菌在15、35 ℃均不产生分生孢子，25 ℃为病菌分生孢子产生的最适温度。本研究在菌丝生长的温度范围，最适温度的上、下限，产孢与孢子萌发的最适温度方面与前人研究结果均存在差异，分析认为与该菌因地理区域、环境差异而存在不同生理小种的分布相关。董金皋等[17]报道玉米大斑病1、2号生理小种在菌丝生长速度、菌丝生长量、孢子产生量以及致病毒素产生量等生物学特性方面的温度效应存在着一定的差异，进一步证实了这一相关性。杨信东等[18-19]对玉米大斑病田间病叶病斑研究表明，病斑上的病菌在5 ℃以下、35 ℃以上基本不能产孢，在10 ℃以上开始产孢，产孢适温大体在20～26 ℃，25 ℃孢子萌发率最高，达96%，孢子萌发、附着孢形成与侵入适温大体在20～27 ℃，这一规律与本研究结果相似。这些特性与该病害每年8月高温季节在甘肃河西走廊玉米田易于发生流行基本吻合。因此，这一试验结果可为玉米大斑病生理小种监测、流行预测和防治提供科学依据。

试验结果表明，该菌在pH 3～11的环境中菌丝和分生孢子均能生长萌发，pH 7和8时菌丝生长最快；pH 7时产孢量7.03×105个/mL为最多，pH 8产孢量次之；分生孢子萌发适宜pH为6～8，pH 7时萌发率最高，达80.67%。其变化趋势表明，该菌在弱碱性条件下有利于菌丝生长与孢子萌发，在中性偏碱环境下有利于产孢。浦子钢[14]报道pH 7时菌落直径增长最快，pH 6～10生长均表现良好，pH 7时孢子萌发率最高为78.9%，pH >8萌发率有所下降，弱碱条件下生长略优于酸性条件，这一变化规律与本研究结果相吻合。与宋文静等[20]报道河北省玉米大斑病菌0号小种的孢子萌发最适pH 5.0～7.0存在差异，说明不同菌株孢子萌发对酸碱适应性存在差异。因此，在生产上采取检测叶部大斑病菌生长扩展的菌态，有针对性的选择偏酸或偏碱性的杀菌剂叶面喷雾，以抑制菌丝生长、产孢和孢子萌发，降低侵染机率，达到防治大斑病的目的。

本研究结果表明，12 h/d光照+12 h/d黑暗的半光半暗环境下菌丝生长最快，半光半暗、全黑暗条件下产孢量和萌发率最大，与冯胜泽等[16]、姜开梅等[21]报道的12 h光暗交替培养条件下有利于菌丝生长和产孢量最大的研究结果相一致。本研究结果证实了低光照条件有利于该病害的发生规律，与该病害在田间易出现于中下部叶片的规律相吻合。因此，在生产实践中通过调整种植密度，改善田间光照条件，减轻病害的发生。

从碳源、氮源对该菌生长和产孢影响试验看，该菌对营养成分的需求存在一定差异，最有利于菌丝生长碳源为葡萄糖和木糖，最佳氮源为甘氨酸；最有利于产孢的碳源为果糖和乳糖、木糖；最利于孢子萌发的碳源为葡萄糖溶液，氮源为蛋白胨溶液；供试7种氮源的产孢量显著低于无菌水对照处理，氯化铵、硫酸铵等无机氮源对产孢和孢子萌发具有抑制作用，这一结果与浦子钢[14]、冯胜泽等[16]前人研究结果相一致。杨信东等[22]试验证实，大斑病对氮肥比较敏感，肥力水平与大斑病菌侵染机率呈显著负相关，肥力水平较高条件下大斑病发生较轻。因此，本试验结果为研究玉米田间肥力水平对大斑病菌的抗性机制提供了科学依据。