沉默NCAPH基因对子宫内膜癌细胞恶性生物学表型影响的研究

杨夏楠，赵丹丹，司 晗，杨平娟，樊冬梅

河南科技大学第一附属医院妇三科，河南 洛阳 471003

子宫内膜癌（Endometrial Cancer，EC）是女性中第四大常见癌症，也是最常见的妇科癌症。子宫内膜癌是一种具有侵袭或转移能力的恶性肿瘤，主要发生在更年期和绝经后妇女中［1］。子宫内膜癌根据病因和临床行为可以分为I 型和II 型。I 型肿瘤是雌激素依赖性高分化腺癌，起源于子宫内膜增生，占子宫内膜癌病例的80%。与I 型肿瘤相反，II 型肿瘤是不依赖雌激素的、分化差的腺癌，其起源于萎缩性子宫内膜［2］。在我国，随着社会的发展和经济条件的改善，子宫内膜癌的发病率亦逐年升高，因此，阐明子宫内膜癌的发病机制对提高子宫内膜癌患者的生存时间至关重要。

非SMC 缩合蛋白I 复合物亚单位H（non-SMS condensin Ⅰcomplex subunit H，NCAPH），称为凝聚素，在有丝分裂和减数分裂过程中参与染色体的组装和分离，对维持染色体的结构和分离至关重要［3］。近年来，研究发现，NCAPH 在多种肿瘤的发生和发展过程中起重要作用［4］。Kim 等［5］发现，NCAPH 在胰癌的临床组织和细胞系中表达上调，且沉默NCAPH 可以通过激活DNA 损伤反应（Chk1/Chk2）信号通路诱导染色体的畸变和DNA损伤，进而抑制胰癌细胞的增殖和诱导胰癌细胞的凋亡［5］。Sun等［6］发现，超表达NCAPH 可以促进肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，表明NCAPH 可以作为一种新的预后生物标志物和肝细胞癌患者的潜在治疗靶点。Cui 等［7］发现，NCAPH 的表达水平在前列腺癌中显著上调，且NCAPH 的过表达与前列腺癌患者的不良生存率有关。Yin等［8］发现，NCAPH 在结肠癌组织中的表达水平明显高于其在相邻非癌组织中的表达水平，且沉默NCAPH 可以抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和异种移植肿瘤的形成。然而，NCAPH在子宫内膜癌中的具体作用至今尚不清楚。

本研究通过构建NCAPH 沉默的细胞模型，探究NCAPH在子宫内膜癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT过程中的作用，为今后子宫内膜癌的诊断和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

正常人子宫内膜细胞（hEEC），子宫内膜癌细胞（Ishikawa，RL95-2 和KLE）均购自武汉普诺赛生物科技有限公司；si-NCAPH 和其阴性对照si-NC 购自苏州贝信生物技术有限公司；CCK-8试剂盒购买于碧云天生物生物技术；DMEM 培养基、Trizol 试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒均购自上海赛默飞世尔科技有限公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogene公司。

1.2 细胞培养

将子宫内膜癌Ishikawa 和KLE 细胞接种在含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM 培养基内，在恒温37 ℃含有5%CO2的培养箱中培养，待Ishikawa 和KLE 细胞生长至培养瓶底部铺满细胞进行细胞传代，收集生长状态良好的细胞用于后续实验。

1.3 细胞转染

细胞转染前一天将细胞接种到6 孔板中，待细胞转染时长至70%的融合度，使用Lipofectamine 2000将si-NCAPH和si-NC 转染到Ishikawa 和KLE 细胞中。转染后继续培养细胞48 h，然后收取细胞，通过qRT-PCR 和western blot检测NCAPH的表达水平。

1.4 CCK-8

将转染后的Ishikawa 和KLE 细胞重悬，然后接种到96孔板中，培养24 h、48 h或者72 h后，按照试剂盒操作步骤，每孔加入10 μL 的CCK-8 试剂，在95%空气、5%CO2的37 ℃条件下孵育3 h，随后使用酶标仪在450 nm 处检测吸光度OD值。

1.5 划痕愈合实验

将转染后的Ishikawa 和KLE 细胞接种到6 孔板中，待细胞长至基本融合时用10 μL 无菌枪头垂直6 孔板划痕，用PBS 清洗Ishikawa 和KLE 细胞3 次，然后放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，然后在显微镜下观察并随机选取5 张视野拍照，通过Image J 图像处理软件量化迁移面积，计算其迁移率。

1.6 Transwell实验

收集转染后的Ishikawa 和KLE 细胞，用无血清的培养基将其重悬，然后将细胞悬液接种到预先涂有基质胶的Transwell 上室，下室加入含有血清的完全培养基。在37 ℃、5% CO2的条件下培养24 h后，取出Transwell小室，弃去孔内培养基，擦去上层小室内的细胞。将细胞用甲醇固定30 min，并用0.1%结晶紫染色10 min，显微镜下观察并随机选取5张视野拍照，对侵袭细胞进行计数。

1.7 RT-qPCR

通过Trizol 试剂（Takara，Tokyo，Japan）从Ishikawa和KLE细胞中提取的总RNA，使用逆转录试剂盒（Takara）合成cDNA，然后使用SYBR Prellix Ex Taq RT-qPCR 试剂盒（Takara）和NCAPH 特异性引物进行RT-qPCR 反应。以β-actin 作为内参基因，使用2-△△Ct方法计算基因mRNA的相对表达水平。

1.8 Western Blot

用RIPA 蛋白裂解液从细胞中提取总蛋白，使用BCA蛋白质测定试剂盒测定总蛋白质浓度，使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质进行分离，并转移到PVDF膜上，PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭，后加入NCAPH 和β-action 抗体（稀释比例为1∶1 000），4℃孵育过夜，再加入二抗，37 ℃孵育1 h，通过ECL 化学发光液显影后在化学发光成像系统拍照，应用Image J图像处理软件进行定量分析。

1.9 统计学方法

采用Graphpad Prism 软件进行数据统计学分析，组间数据比较采用t检验或者单因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NCAPH在子宫内膜癌中的表达水平

基于TCGA数据库分析NCAPH在正常子宫内膜和子宫内膜癌中的表达水平。如图1A和1B所示，NCAPH 在癌旁组织的表达水平明显低于其在子宫内膜癌的表达水平，差异有统计学意义（P＜0.001）。

图1 NCAPH在子宫内膜癌中的表达水平

2.2 NCAPH 在子宫内膜癌中的诊断价值及其与预后的关系

ROC 曲线分析结果显示，NCAPH 在子宫内膜癌具有临床诊断价值（图2A）。此外，使用KM-plotter 在线数据库进行生存分析，如图1B 所示，NCAPH 高表达子宫内膜癌患者的总生存期（图2B）和无进展生存期（图2C）比NCAPH 低表达的子宫内膜癌患者的总生存期较短，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 NCAPH在子宫内膜癌中的诊断价值及其和预后的关系

2.3 NCAPH 在正常子宫内膜细胞及子宫内膜癌细胞中的表达水平

使用qRT-PCR 和Western blot 实验分析正常子宫内膜细胞hEEC 和子宫内膜癌细胞Ishikawa、RL95-2 和KLE 中NCAPH 的表达情况。由图3 可知，与正常子宫内膜细胞hEEC 细胞相比，NCAPH 在子宫内膜癌Ishikawa、RL95-2和KLE 细胞的表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.001）。

图3 正常子宫内膜细胞及子宫内膜癌细胞中NCAPH的表达

2.4 沉默NCAPH对子宫内膜癌细胞增殖的影响

用si-NC和si-NCAPH转染Ishikawa和KLE细胞，转染48 h后，研究用qRT-PCR和Western Blot检测NCAPH的表达。图4A 和4B 结果显示，在Ishikawa 和KLE 细胞中，与si-NC 相比，si-NCAPH 组中NCAPH 的表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.001）。

图4 沉默NCAPH对Ishikawa和KLE细胞增殖能力的影响

使用CCK-8 方法检测沉默NCAPH 对子宫内膜癌Ishikawa 和KLE 细胞增殖活性的影响，如图4C 和4D 所示，与si-NC 组相比，si-NCAPH 组Ishikawa 和KLE 细胞的增殖活性明显下降，且差异有统计学意义（P＜0.001），表明沉默NCAPH可以降低子宫内膜癌细胞的增殖能力。

2.5 沉默NCAPH 对子宫内膜癌细胞迁移和侵袭能力的影响

Ishikawa 和KLE 细胞转染si-NC 或si-NCAPH 24 h 后，研究者进行划痕愈合实验，评估Ishikawa 和KLE 细胞的迁移能力。如图5A 所示，与si-NC 组Ishikawa 和KLE 细胞的迁移率相比，si-NCAPH 组Ishikawa 和KLE 细胞的迁移率显著下降，差异有统计学意义（P＜0.001）。结果表明沉默NCAPH 抑制子宫内膜癌细胞的迁移能力。与此同时，Transwell 小室实验的结果表明，与si-NC 组相比，si-NCAPH 组Ishikawa和KLE细胞的侵袭能力明显下降，见图5B。由此可见，沉默NCAPH 可以抑制子宫内膜癌细胞侵袭和迁移能力。

图5 沉默NCAPH对Ishikawa和KLE细胞迁移能力的影响

2.6 沉默NCAPH对子宫内膜癌细胞中EMT的影响

为了探究沉默NCAPH 对子宫内膜癌细胞中EMT 的影响，研究使用Western Blot方法检测了转染48 h后Ishikawa和KLE细胞中EMT的相关基因E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和N-cadherin 的蛋白表达水平。如图6A 和6B 所示，在Ishikawa 和KLE 细胞中，与si-NC 组相比，敲减NCAPH 可以引起Ishikawa 和KLE 细胞中Ecadherin 的水平显著升高，而引起Ishikawa 和KLE 细胞中Vimentin 和N-cadherin 的蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.001）。

图6 沉默NCAPH抑制Ishikawa和KLE细胞的EMT

3 讨论

子宫内膜癌是最常见的女性生殖系统肿瘤之一，并是导致死亡的第三位常见妇科恶性肿瘤（仅次于卵巢癌和宫颈癌）。近年来子宫内膜癌的发病率仍在不断升高，但是由于女性内分泌系统的复杂性，子宫内膜癌的发病机制至今尚未完全阐明。研究表明子宫内膜癌的发病机制可能与基因的异常表达密切相关［9］。因此，阐明子宫内膜癌的发病机制对提高患者的生存时间尤为重要。

已有研究发现NCAPH 在多种肿瘤的发生和发展过程中起重要作用［10］。沉默NCAPH 可以诱导胃癌细胞G1细胞周期停滞，进而抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭［11］。在浆液性卵巢癌中，NCAPH 的表达水平明显升高，且NCAPH 的表达水平与浆液性卵巢癌的组织学肿瘤分级和淋巴转移呈正相关，而与浆液性卵巢癌患者的总生存时间呈负相关。由此可见，NCAPH 有望成为浆液性卵巢癌的预后标志物和治疗靶点。同样地，Qi等［12］发现NCAPH 可以通过上调PI3K/PDK1/AKT通路促进卵巢癌的发展。在宫颈癌中，NCAPH 的表达水平明显高于其在正常宫颈和高级别鳞状上皮内病变组织中的表达水平，且其表达水平与肿瘤大小、浸润深度和淋巴结转移明显相关。此外，高表达NCAPH 的宫颈癌患者的生存结果明显比低表达NCAPH的宫颈癌患者的生存结果更好，且沉默NCAPH 可以通过PI3K/Akt/SGK 信号通路抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间充质转化［13］。在膀胱癌中，NCAPH可以通过MEK/ERK 信号通路促进UMUC3细胞的增殖，抑制UMUC3细胞的凋亡［14］。在乳腺癌中，NCAPH 在MCF-7 和MCF-10A 细胞中的表达水平明显升高，且其上调表达与乳腺癌患者的预后不良明显相关，表明NCAPH 有可能作为乳腺癌的预后标志物［15］。在非小细胞癌中，NCAPH 沉默可以抑制A549 和H1299 细胞的增殖，诱导细胞周期在G/M 期停滞，并阻止A549 和H1299 细胞的集落形成、迁移和侵袭［16］。Shimomura 等［17］研究发现，NCAPH 在口腔鳞状细胞癌中的表达高于其在正常口腔黏膜中的表达，且NCAPH 的免疫染色与淋巴结转移和淋巴浸润密切相关。此外，机制研究发现，NCAPH 可以促进内皮细胞向口腔鳞状细胞癌细胞的迁移和黏附，降低口腔鳞状细胞癌细胞对铂类抗癌药物的敏感性。然而，NCAPH 在子宫内膜癌中的功能作用至今尚未见报道。在此，研究通过分析TCGA和KM plotter 数据库发现，NCAPH 在子宫内膜癌组织的表达水平明显高于其在子宫内膜癌旁组织的表达水平，且其表达水平与患者的预后生存时间呈负相关。由此可见，NCAPH 有可能作为促癌基因，在子宫内膜癌的发生发展过程中起重要作用。这与Qiu 等［18］的研究结论一致，NCAPH 在子宫内膜癌中上调并且与较差的临床病理学特征相关。本研究通过在子宫内膜癌细胞中沉默NCAPH 发现，沉默NCAPH 能够导致子宫内膜癌细胞的增殖活性降低。此外，划痕愈合实验和Transwell实验结果显示，沉默NCAPH能够显著抑制子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭能力。

EMT 是指细胞失去上皮特性而获得间质特性的动态可逆过程，在胚胎发育、伤口愈合、癌症转移和纤维化等过程中发挥了重要作用。EMT 的主要特征有细胞黏附分子（如E-cadherin）表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为Vimentin 为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征。在EMT过程中，细胞将失去其黏附和极性特征，上皮细胞的标志物E-cadherin 的表达水平逐渐降低，而间充质细胞的标志物Vimentin 和N-cadherin 的表达水平会逐渐升高，而且N-cadherin 可以通过其锌指结构与E-cadherin 启动子区域的E-box元件结合而直接抑制E-cadherin的表达，从而启动EMT 过程。然而，NCAPH 是否参与子宫内膜癌细胞的EMT 过程尚未见报道。本研究通过Western blot 检测了EMT 相关基因的表达水平，结果发现，沉默NCAPH上调了子宫内膜癌细胞中E-cadherin 的表达水平，同时下调了Vimentin 和N-cadherin 的表达水平。这些结果表明，沉默NCAPH抑制了子宫内膜癌的EMT过程。

综上所述，NCAPH 在子宫内膜癌组织和细胞中异常过表达，沉默NCAPH 能够抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。因此，NCAPH 有希望成为诊断子宫内膜癌患者的有效生物标志，并可能作为治疗子宫内膜癌的潜在基因靶点，但是其中的分子机制还需要进一步的研究和证明。