DNA 甲基化在食管鳞状细胞癌中的研究进展△

杨志珍，谈艳芳

1成都中医药大学医学技术学院，成都 610000

2德阳市人民医院检验科，四川 德阳 618000

食管癌是一种食管上皮来源的高度恶性肿瘤，2018 年全球癌症统计数据显示，全球食管癌病死率居第6 位，发病率居第7 位，其恶性程度高，预后差[1]。2018 年中国食管癌新发病例数和死亡病例数分别居全部恶性肿瘤的第6 位和第4 位[2]。食管鳞状细胞癌为食管癌的主要亚型，约占食管癌总数的90%，并且患者5 年生存率﹤30%[3]。文献提示，DNA 甲基化作为一种表观遗传修饰，是目前发现的在食管鳞状细胞癌分子诊断中具有广泛应用前景的生物学标志物，在食管鳞状细胞癌的发生和发展中起到重要作用[4]。与传统影像、内镜、病理等检查相比，DNA 甲基化检测灵敏度高、特异性强、创伤小、无辐射，适合人群早期筛查，在食管鳞状细胞癌的早期诊断、药物治疗、转移及预后评估方面显示出了巨大优势。因此，本文综述DNA 甲基化在食管鳞状细胞癌中的研究进展。

1 DNA 甲基化

DNA 上的表观遗传标记是可逆的、可遗传的修饰，能在不改变DNA 序列的前提下，改变基因的功能或活性。DNA 甲基化是一种重要的表观遗传学改变，是DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化DNA 序列上的特定碱基，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosine methionine，SAM）为甲基供体，通过共价键得到甲基的化学修饰过程，这种DNA 甲基化主要指基因组中CpG 二核苷酸胞嘧啶第5 位碳原子的甲基化过程，是哺乳动物DNA 甲基化的唯一形式[5]。根据序列的同源性和功能，真核生物DNMT 目前分为4 种，即DNMT1、DNMT3a、DNMT3b 和DNMT3L。DNMT1 参与CG 序列甲基化的维持；DNMT3a和DNMT3b也被称为从头甲基化转移酶，可以为未修饰的DNA 建立新的甲基化模式；DNMT3L 没有催化活性，是一种缺乏甲基转移酶催化结构域的蛋白质，通过与DNMT3a和DNMT3b 结合，发挥甲基转移酶的作用[5]。DNA甲基化通过改变染色质结构、DNA 构象、DNA 稳定性以及DNA 与蛋白质相互作用等方式，参与细胞分化、基因组稳定性、X 染色体失活、基因印迹等细胞生物学过程，从而控制基因表达[6]。

2 肿瘤与DNA 甲基化

国际癌症研究机构于2018 年发布的《世界癌症报告》中指出，在134 个国家中，肿瘤是导致过早死亡（即30～69 岁死亡）的第一大或第二大原因，在另外45 个国家中，肿瘤是导致过早死亡的第三大或第四大原因，全世界的肿瘤发病率和病死率都在上升，与2008 年相比，2018 年全球肿瘤新发病例和死亡病例分别约1810 万和960 万，新发病例较2008 年增长了42.5%，死亡病例较2008 年增长了26.3%，排名前十位的肿瘤依次为肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、食管癌、宫颈癌、甲状腺癌、膀胱癌，占肿瘤总发病例数的60.8%[1]。肿瘤对人类健康造成严重威胁，加重了国家经济负担，也将可能成为人口预期寿命增长的主要障碍。

DNA 甲基化与肿瘤的发生发展有着密切的关系，已被证明是许多肿瘤的重要标志。DNA 甲基化异常会导致基因异常表达，使其成为肿瘤进展的重要调控因子。因此，通过对DNA 甲基化进行分析，可为早期识别不同的肿瘤类型提供新的可能。DNA 是稳定的，容易从不同种类的物质中分离出来，DNA 甲基化是可逆的，可以很容易地被检测和分析，这可能会成为一种有效的检测方法。DNA 甲基化标志物的检测对于肿瘤的早期筛查、诊断、治疗、预后评估是至关重要的。

3 食管鳞状细胞癌与DNA 甲基化

食管鳞状细胞癌经历了一个缓慢、多阶段、双向的转化过程，可有不同程度的炎症、不典型增生、低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变，最终发展为肿瘤，预防和治疗食管鳞状细胞癌的紧迫性是显而易见的。食管鳞状细胞癌的发生是一个多因素的复杂过程，是原癌基因激活和抑癌基因因遗传和表观遗传变化而失活的结果。这种基因的表观遗传修饰在一定条件下是可逆的，且不依赖于DNA 序列的变化，特别是DNA 甲基化异常是食管鳞状细胞癌的常见表观遗传学改变。

3.1 DNA 修复相关基因

食管鳞状细胞癌中DNA 修复基因O-6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）和mutL 同源物1（mutL homolog 1，MLH1）的失活主要归因于其启动子区域的甲基化[7]。避免细胞从鸟嘌呤（G）突变为腺嘌呤（A），以保持基因组的准确性和完整性，其功能异常会影响DNA 的修复能力，从而增加肿瘤发生过程中的突变率。有学者在对原发性食管鳞状细胞癌患者的研究中发现，脆性组氨酸三联体二腺苷三磷酸酶（fragile histidine triad diadenosine triphosphatase，FHIT）基因与基因组稳定性及肿瘤进展相关，FHIT基因的甲基化与吸烟相关；由于其常发生在食管鳞状细胞癌的早期，因此可以作为早期食管鳞状细胞癌潜在的预后生物标志物，在食管鳞状细胞癌未进行淋巴结转移及远处转移前被检测出，大大提高了食管鳞状细胞癌的诊断率及治疗效果[8]。

3.2 细胞周期相关基因

在鳞状细胞癌中，一些细胞周期相关基因的启动子被高甲基化，从而抑制了它们的表达。细胞周期相关基因细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）和Ras 相关结构域家族成员1A（Ras association domain family member 1A，RASSF1A）在食管鳞状细胞癌中经常被高甲基化和转录沉默[7]。叉头框和环指结构域检查点（checkpoint with forkhead and ring finger domains，CHFR）启动子区甲基化在食管鳞状细胞癌中经常被发现，已有研究通过对食管鳞状细胞癌患者肿瘤组织及癌旁组织的研究发现，随着组织异型增生级别的增加，CHFR甲基化呈现逐渐升高的趋势，当用多西他赛或紫杉醇治疗时，CHFR甲基化食管鳞状细胞癌细胞的活力低于未甲基化的细胞，说明CHFR甲基化可降低食管鳞状细胞癌细胞对多西他赛或紫杉醇的敏感性，可通过监测CHFR甲基化程度判断食管鳞状细胞癌的病变程度及这两种药物的化疗效果[9]。肿瘤抑制基因p16是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，有研究显示，随着食管病变严重程度的增加，细胞学标本中p16甲基化频率呈增加趋势，p16甲基化与食管鳞状细胞癌的发生风险显著相关[10]。

3.3 细胞凋亡相关基因

谷胱甘肽S-转移酶P1（glutathione S-transferase pi 1，GSTP1）是一种致癌物质，与烟草代谢相关，食管鳞状细胞癌的发病过程可能与GSTP1的多态性相关。有学者对食管鳞状细胞癌组织的研究显示，GSTP1多态性作为食管鳞状细胞癌的独立危险因素，通过体细胞CpG 岛启动子失活的GSTP1在各种肿瘤亚型中被证明是高甲基化的，GSTP1基因去甲基化后，细胞增殖率降低，凋亡率增加，食管鳞状细胞癌受到抑制，肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性增加，提示GSTP1基因去甲基化可能会抑制食管鳞状细胞癌的发生，提高食管鳞状细胞癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[11]。

3.4 侵袭转移相关基因

钙黏蛋白1（cadherin 1，CDH1）基因位于染色体16q24 上，编码E-钙黏蛋白（E-cadherin），在维持正常上皮细胞的细胞连接中起着关键作用。在食管鳞状细胞癌中，CDH1基因甲基化率为14%～61%，与早期食管鳞状细胞癌的复发相关，其表达丧失与食管鳞状细胞癌的侵袭、转移和预后不良有关[12-14]。去甲基化后，CDH1基因在食管鳞状细胞癌中的表达恢复，说明CDH1基因的沉默与其启动子区的高甲基化有关[15]。有研究发现，食管鳞状细胞癌组织中蛋白酪氨酸磷酸酶非受体6 型（protein tyrosine phosphatase non- receptor type 6，PTPN6）基因的甲基化率为63.4%，PTPN6甲基化水平可能与食管鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭有关[16]，可作为食管鳞状细胞癌转移的生物标志物，对临床监测食管鳞状细胞癌的转移具有重要意义。

3.5 WNT 信号通路基因

WNT/β-catenin 信号通路被报道与人类食管鳞状细胞癌的发生和发展有着密切联系，在许多食管鳞状细胞癌病例中发现WNT 通路的基因改变[17]。WT1 转录因子（WT1 transcription factor，WT1）通过作用于WNT/β-catenin 通路上游而促进上皮-间充质转化，有研究发现，WT1在食管鳞状细胞癌中因启动子甲基化而表达失调[18]。APC 是WNT 通路抑制因子，食管鳞状细胞癌中APC启动子高甲基化的患者转移淋巴结较少，预后较好，可以作为食管鳞状细胞癌的预后标志物[19]。WNT5a在食管鳞状细胞癌中出现高频甲基化[20]。DNA 甲基化标志物已被报道用于评估食管鳞状细胞癌的复发风险，有研究结果证明，锌指蛋白382（zinc finger protein 382，ZNF382）作为一种良性肿瘤抑制因子，其启动子甲基化与食管鳞状细胞癌分化水平相关，并通过抑制WNT通路来抑制食管鳞状细胞癌的恶化[21]。

3.6 转化生长因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）通路基因

转化生长因子-β 受体2（transforming growth factor beta receptor 2，TGFBR2）是一种重要的肿瘤抑制因子，是TGF-β信号转导的关键介导因子。有研究表明，食管鳞状细胞癌组织样本中TGFBR2启动子相关CpG 位点的甲基化水平高于正常食管组织样本，TGFBR2启动子不仅在从非典型增生到癌变的过程中表现出高甲基化，而且在从正常上皮到癌变的过程中也表现出高甲基化，TGFBR2在食管鳞状细胞癌中由于其启动子区DNA 超甲基化而表达下调，食管鳞状细胞癌中TGFBR2CpG 高水平甲基化提示TGFBR2启动子区DNA 甲基化可能导致TGFBR2mRNA 表达缺失或降低，从而促进食管鳞状细胞癌的癌变，用DNMT 抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理肿瘤细胞，可逆转TGFBR2启动子的甲基化[22]。研究TGFBR2 在食管鳞状细胞癌中的作用，可以更深入了解该疾病的发展机制，并可能成为食管鳞状细胞癌患者个体化治疗的生物标志物。

3.7 其他基因

Rh 家族C 糖蛋白（Rh family C glycoprotein，RHCG）是一种新的抑癌基因，在食管鳞状细胞癌的发生发展中起着重要的作用。RHCG 通过抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路和基质金属蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1，MMP1）表达抑制食管鳞状细胞癌的发生和转移，具有评估食管鳞状细胞癌患者预后的潜力[23]。胰岛素样生长因子结合蛋白样1（insulin like growth factor binding protein like 1，IGFBPL1）在食管鳞状细胞癌中的表达受启动子区甲基化的调控，IGFBPL1的甲基化与肿瘤大小和TNM 分期有关，IGFBPL1 通过抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路抑制食管鳞状细胞癌细胞生长，IGFBPL1甲基化是一种潜在的食管鳞状细胞癌早期检测标志物，也是食管鳞状细胞癌PI3K 靶向治疗的预测标志物[24]。配对盒5（paired box 5，PAX5）基因甲基化被确定为检测食管鳞状细胞癌的一个很好的标志物，其高甲基化与食管鳞状细胞癌细胞增殖和顺铂耐药显著相关[25]。Piwi 相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）-823 作为一种新型的非编码小分子RNA，在食管鳞状细胞癌中具有作为诊断和预后生物标志物的潜力，其可能通过表观遗传途径DNMT3b 诱导DNA 甲基化，从而在食管鳞状细胞癌中发挥致癌作用[26]。EYA 转录辅激活因子和磷酸酶4（EYA transcriptional coactivator and phosphatase 4，EYA4）在大多数被检测的食管鳞状细胞癌细胞系中存在低表达和高甲基化，用5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理后可恢复食管鳞状细胞癌细胞系中EYA4 的表达，EYA4 通过失活AKT/糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3B）/Slug 通路和抑制上皮-间充质转化抑制食管鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭，可能与食管鳞状细胞癌TNM 分期和淋巴结转移相关[27]。半胱氨酸双加氧酶1（cysteine dioxygenase type 1，CDO1）具有酶活性，其甲基化在食管鳞状细胞癌中很常见，具有抑制肿瘤细胞活性的作用，CDO1 的表达通过降低MDA-MB-231 细胞的活性氧（reactive oxygen species，ROS）解毒能力来降低细胞活性，CDO1甲基化可能是原发性食管鳞状细胞癌的一个强有力的预后预测因子，并对食管鳞状细胞癌的治疗具有重要的临床意义[28]。

4 DNA 甲基化作为食管鳞状细胞癌化疗敏感性的标志物及治疗靶点

DNA 甲基化异常是食管鳞状细胞癌中常见的表观遗传学改变。DNA 甲基化失调会导致肿瘤抑制基因失活和原癌基因激活。DNA 是稳定的、可逆的，容易从不同种类的物质中分离出来，这为肿瘤的治疗提供了新的机会。因此，可以应用去甲基化药物来恢复抑癌基因的表达，从而抑制肿瘤的发展。DNA 甲基化状态可评估患者对化疗的敏感性。关于DNA 甲基化作为食管鳞状细胞癌化疗敏感性标志物的报道非常有限。PAX5甲基化被确定为鳞状细胞癌的一个很好的标志物，PAX5的高甲基化与食管鳞状细胞癌细胞增殖和顺铂耐药显著相关，PAX5高甲基化可抑制食管鳞状细胞癌细胞增殖，增加细胞对化疗药物顺铂的耐药性，导致无复发生存期和总生存期延长[25]。GSTP1的DNA甲基化是LINC01419 促进食管鳞状细胞癌进展和5-氟尿嘧啶化疗耐药的原因，下调LINC01419 的表达可增加食管鳞状细胞癌细胞在体内对5-氟尿嘧啶的敏感性，GSTP1基因去甲基化后，可使细胞增殖减少，凋亡增加，食管鳞状细胞癌的发展受到抑制，肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性增加，提示GSTP1基因去甲基化可能抑制食管鳞状细胞癌的发生，提高食管鳞状细胞癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[11]。

5 小结与展望

表观遗传改变已被认为是食管鳞状细胞癌发生、发展的关键因素。DNA 甲基化是食管鳞状细胞癌早期研究最广泛的表观遗传修饰之一，可作为食管鳞状细胞癌早期筛查、诊断、治疗、预后评估和化疗敏感性的标志物。本文总结了食管鳞状细胞癌发生、发展过程中一些基因异常甲基化对食管鳞状细胞癌预防、诊断及治疗等方面的影响。在食管鳞状细胞癌中，表观遗传调控机制和DNA 甲基化分子标志物尚待进一步研究，未来可建立食管鳞状细胞癌的诊断、预防、转移模型，为临床医师提供有价值的食管鳞状细胞癌早期筛查、防治工具，这对于提高食管鳞状细胞癌患者的生存率、及时挽救患者生命具有非常重要的意义。