m6A 去甲基化酶alkB 同源物5 在非小细胞肺癌中的研究进展△

孙月，李媛媛

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院科技学术部，哈尔滨 150081

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是人类恶性肿瘤死亡的主要原因之一。尽管近年来肺癌在早发现、早诊断及手术、放疗、化疗和药物治疗方面有所改善，但肺癌患者的5 年生存率仍然较低[1]。肺癌的病理类型主要包括非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌，NSCLC 最为常见。值得注意的是，已有研究证明60%～70%的NSCLC 患者的不良预后与肿瘤转移有关[2]。导致NSCLC 患者生存率低的主要原因如下：NSCLC 的早期症状通常不明显，大多数患者发现时已处于中晚期；医学统计发现，仅少数NSCLC患者在早期被诊断，接受根治性手术治疗才能延长生存期；转移是肿瘤细胞从肿瘤起源部位扩散到身体远处部位的复杂过程，是恶性肿瘤患者死亡的最常见原因[3]。术后肿瘤复发和远处转移非常常见，约50%的NSCLC 患者在5 年内出现复发和转移；靶向治疗和免疫治疗的患者数量非常有限，尽管靶向治疗和免疫治疗非常有效，但尚未明确其具体的分子机制，临床上常用的靶向药物包括表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）（如厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼），免疫治疗药物包括程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）/程序性死亡受体配 体 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）抑制剂（如派姆单抗、尼鲁单抗）[4]。因此，研究NSCLC 发生发展的分子机制，制订有效的诊断和治疗策略，对提高肺癌患者的生存率具有重要意义，目前迫切需要开发更多新的肺癌分子靶点。alkB 同源物5（alkB homolog 5，ALKBH5）是一种重要的m6A 去甲基化酶，在不同肿瘤中的表达水平、目标基因以及发挥的作用均不同。本文围绕ALKBH5 的结构、作用机制、在NSCLC 恶性进展中的生物学功能及针对ALKBH5修饰的靶向治疗等方面的研究进展进行综述，旨在为NSCLC 的早期临床诊断和靶向药物的研发提供新思路。

1 m6A 概述

关于肿瘤的发病机制，DNA 和RNA 修饰的表观遗传学已被广泛研究[5-6]，其中，m6A 修饰是新兴的研究前沿，是指RNA 腺苷酸的N6 位置发生甲基化修饰。m6A 可修饰不同类型的RNA，包括转运RNA（transfer RNA，tRNA）、信使RNA（messenger RNA，mRNA）、核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）、核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）和长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）等，上述均是在真核生物中转录后修饰[7]。研究发现，m6A 修饰存在于超过7600 个mRNA 和超过300个非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）中[8]。m6A 修饰可以改变RNA 的加工过程，如剪接、输出、细胞内分布稳定性和翻译[9]。细胞中的m6A 状态受到一系列调控因子的严格调控，包括m6A 甲基转移酶（称为“甲基化执行者”）、去甲基化酶（称为“m6A 位点识别者”）和m6A 结合蛋白（称为“去甲基化执行者”）。ALKHB5 是alkB 家族的一员，在调控许多生物学过程中发挥重要作用，如mRNA加工[6]。研究发现，ALKBH5 在人类恶性肿瘤的发生发展过程中起着重要作用，能够抑制结肠癌细胞转移[6,8,10]。另有研究发现，m6A 修饰对肿瘤的起始和进展至关重要[11]。

2 ALKBH5 概述

ALKBH5 是一种m6A 去甲基化酶，近年来，ALKBH5 在许多生物学过程中的作用已被证实，包括肿瘤细胞增殖[11]、侵袭[12]、转移[13]、渗透[14]等过程。此外，ALKBH5 还参与了各种肿瘤和非肿瘤的发生发展过程，如胃癌[13]、胶质母细胞瘤[15]、胰腺癌[16]、结肠癌[17]、乳腺癌[18]、肺癌[19]、卵巢癌[20]、糖尿病[21]以及生殖系统疾病[22]。

2.1 ALKBH5 的结构

ALKBH5 是alkB 蛋白家族成员之一，是一种依赖亚铁和2-氧戊二酸的核酸加氧酶，据报道，ALKBH5 可以催化RNA 中的m6A 去甲基化[23-25]。Zhou 和Han[26]及Aik 等[27]鉴定了ALKBH5 的晶体结构，并揭示了去甲基化机制中很重要的保守残基。Chen 等[28]和Feng 等[29]分别鉴定了斑马鱼ALKBH5（fALKBH5）和人类ALKBH5 的晶体结构，促进了对ALKBH5 底物识别特异性的理解。此外，Xu 等[30]通过等温滴定量热法发现了ALKBH5 的m6A 结合部位和与m6A 识别相关的关键残基。此外，m6A作为一种“构象标记”，在RNA中通过诱导不同的构象影响其与ALKBH5 的相互作用[31]。DEAD 盒解旋酶3（DEAD-box helicase 3，DDX3）是DEAD 盒RNA 解旋酶家族成员，研究发现，ALKBH5 的DSBH 结构域与DDX3 的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）结构域相互作用，在细胞周期、凋亡和RNA 代谢等关键生物学过程中发挥重要作用[32]。alkB 同源物9（alkB homolog 9，ALKBH9，又称FTO）与ALKBH5 的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）也有很大的联系[33-34]。Purslow 和Venditti[35]采用alkB 蛋白无序构象状态的原子解析模型进一步研究了ALKBH5 在溶液中的结构，发现ALKBH5 的主要活性部位为1H、15N、13C。

2.2 ALKBH5 的作用机制

ALKBH5 在人类恶性肿瘤中的潜在机制尚不清楚，且存在争议。迄今为止，研究发现ALKBH5在多种恶性肿瘤中的表达均上调或下调，并在乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌等肿瘤中发挥致癌或抑癌作用[17,13,23]。ALKBH5 的作用机制与lncRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）、mRNA 的表达相关[13,20,23]，同时，ALKBH5 通过介导RNA 之间的通信进一步调控肿瘤细胞增殖、凋亡、存活、迁移、侵袭等重要的生物学过程[24-25]。

2.2.1 ALKBH5 调控lncRNA 转录 FOXM1 反义RNA（RNA antisense to FOXM1，FOXM1-AS）是细胞核内位于12 号染色体上（chr12：2945982-2968961，GRCh37/hg19）的lncRNA，是ALKBH5 和叉头框蛋白M1（forkhead box M1，FOXM1）转录过程中的关键因子。FOXM1-AS 与ALKBH5和FOXM1的转录本定位于同一细胞，研究表明，FOXM1-AS 能够上调FOXM1 的表达，并在胶质母细胞瘤的发生发展过程中发挥重要作用[24]。此外，ALKBH5 能够去甲基化lncRNA KCNK15 和WISP2反义RNA1（KCNK15 and WISP2 antisense RNA 1，KCNK15- AS1），使胰腺癌组织中lncRNA KCNK15-AS1 表达下调，从而提高胰腺癌细胞的运动性，包括细胞迁移和侵袭[25]。ALKBH5 能够抑制lncRNA 浆细胞瘤变异易位1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）降解，使PVT1 在骨肉瘤组织和细胞中表达上调，进而与m6A 阅读器YTH 结构域家族蛋白（YTH domain family，YTHDF）2 结合，促进骨肉瘤细胞的体外增殖和体内生长。另有研究表明，ALKBH5 能够降低NSCLC 中lncRNA 核旁斑点组装转录本1（nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1）的表达水平[13]。由此可见，ALKBH5 可以通过调控lncRNA 转录影响肿瘤的生物学进程。

2.2.2 ALKBH5 调控肿瘤干细胞 肿瘤干细胞又称肿瘤起始细胞，具有自我更新复制的能力，可产生与其不同的子代，并形成继发性（复发性或转移性）肿瘤。ALKBH5 通过催化Nanog 同源框蛋白（Nanog homeobox，NANOG）mRNA 3'非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）中的腺苷残基去甲基化，促进乳腺癌干细胞（breast cancer stem cell，BCSC）在肿瘤微环境中的特化和富集[23]。ALKBH5 在胶质母细胞瘤干细胞样细胞中的表达升高，能够去甲基化FOXM1新生转录本，增强FOXM1 的表达，从而促进干细胞遗传、增殖和肿瘤发生[24]。

2.2.3 ALKBH5 调控自噬 在肿瘤细胞的凋亡-抵抗作用中，自噬可通过相关细胞死亡通路提高化疗或放疗诱导的细胞毒性。沉默m6A 相关基因甲基转移酶样3（methyltransferase like 3，METTL3）可增强自噬通量并抑制缺氧导致的心肌细胞凋亡，但ALKBH5 可以逆转这一现象[35]。转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）通过与ALKBH5启动子结合激活ALKBH5的转录。然而，TFEB 对METTL3 的抑制作用并不依赖于转录抑制，而是下调mRNA 的稳定性。负反馈回路揭示了METTL3-ALKBH5 与自噬之间的重要联系[36]。ALKBH5 的异位表达通过激活表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）/磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3- kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，MTOR）信号通路抑制体内外上皮性卵巢癌细胞的自噬，提高B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）mRNA 的稳定性，增强Bcl-2 与Beclin 1 之间的相互作用[21]。

2.2.4 ALKBH5 介导缺氧肿瘤微环境 肿瘤细胞得到养分就会生长，肿瘤的体积和重量就会变大，从而导致肿瘤细胞更加缺氧，能量转化效率进一步下降，致使细胞更加饥饿，促使细胞从血液流动中获得更多养分，于是形成恶性循环，这可能是肿瘤的主要驱动因素。低氧会诱导乳腺癌细胞表达缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1α和HIF-2α，使ALKBH5 表达上调，通过增强NANOG的表达介导缺氧肿瘤微环境中乳腺癌细胞富集，从而促进体内肿瘤形成[23]。此外，在缺氧/复氧处理的心肌细胞中，TFEB 可促进ALKBH5 表达，并控制溶酶体-自噬通路。ALKBH5 与肺腺癌细胞的间歇性缺氧过程密切相关。机制分析表明，m6A 去甲基化酶ALKBH5 通过下调FOXM1mRNA 中m6A 的水平，增强FOXM1mRNA 的翻译能力，导致FOXM1 蛋白过表达，从而增强了间歇性缺氧条件下肺腺癌细胞的增殖和侵袭能力[37]。

2.2.5 ALKBH5 与肺癌患者的预后 有研究使用LASSO Cox 模型预测5 种调节因子G3BP 应激颗粒组装因子1（G3BP stress granule assembly factor 1，G3BP1）、甲基转移酶样5（methyltransferase like 5，METTL5）、ALKBH5、胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白3（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3，IGF2BP3）和RNA 结合基序蛋白15B（RNA binding motif protein 15B，RBM15B）的m6A 评分，该研究将肺癌患者分为两组，结果发现，m6A 评分高的患者总生存期短于m6A 评分低的患者，差异有统计学意义（P﹤0.05）。在两个分组中验证5 种调节因子（G3BP1、METTL5、ALKBH5、IGF2BP3 和RBM15B）的m6A评分，最终发现这5 种关键因子可以作为评估肺癌患者预后的指标，通过时间依赖性受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线和C指数分析发现，m6A 评分较其他临床特征具有更好的预后预测能力。多中心多变量分析显示，m6A 评分是一个独立的预后指标，5 种调节因子（G3BP1、METTL5、ALKBH5、IGF2BP3 和RBM15B）的m6A评分与肺癌患者的预后相关[38]。有研究者收集119例NSCLC 患者和74 例年龄匹配的健康对照者的外周血，从白细胞中分离总RNA 进行m6A 分析，并回顾性分析受试者的临床特征，结果发现，与健康对照者相比，119 例NSCLC 患者的白细胞m6A 水平显著升高，NSCLC中白细胞m6A水平升高与肿瘤的临床分期和分化程度相关，术后m6A 水平显著降低，NSCLC中白细胞m6A水平升高是由甲基转移酶复合物上调且FTO和ALKBH5下调引起的[39]。

ALKBH5 在人类肿瘤中的作用不是十分明确。目前的研究显示，ALKBH5 在不同肿瘤中的表达水平存在较大差异，发挥致癌或抑癌作用。

3 ALKBH5 在NSCLC 中的作用机制

3.1 ALKBH5 调控NSCLC 细胞增殖

在间歇性缺氧条件下，肺腺癌细胞中ALKBH5表达升高，下调ALKBH5 的表达可通过降低FOXM1 的m6A 水平来抑制肺腺癌细胞的增殖和侵袭[11]。此外，与正常肺组织和细胞相比，ALKBH5在NSCLC 组织和细胞系中的表达明显上调，并通过抑制m6A 去甲基化修饰的mRNA 的稳定性促进NSCLC 细胞的恶性生物学特性[19]。ALKBH5 可通过抑制Yes 相关蛋白（Yes associated protein，YAP）的表达和活性，并以人类抗原R（human antigen R，HuR）依赖的方式调节miRNA-107/大肿瘤抑制激酶2（large tumor suppressor kinase 2，LATS2）信号通路，从而抑制肿瘤的生长和转移[40]。上述结果表明，m6A 修饰YAP 是潜在的NSCLC 治疗靶点。

3.2 ALKBH5 调控NSCLC 干细胞干性

ALKBH5 通过影响p53 的表达调节上皮-间充质转化（epithelial- mesenchymal transition，EMT）和干细胞干性，从而抑制NSCLC 的进展。m6A 去甲基化酶ALKBH5 在由NSCLC 衍生的肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）中高表达。敲除ALKBH5可增加整体m6A 水平和E-钙黏蛋白水平，降低干细胞标志物NANOG 和八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）的表达水平，并抑制CSC 的干性。在NSCLC 中，通过基因表达谱交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）在线工具发现，ALKBH5与p53的表达呈正相关。p53能够在转录水平上调控ALKBH5表达，随后调控整体m6A 甲基化水平。通过添加p53 特异性抑制剂（p-fifty three inhibitor，PFT）抑制p53的转录活性，可显著降低ALKBH5表达水平，从而抑制恶性肿瘤细胞增殖、侵袭和肿瘤形成能力，表明p53 可能通过影响ALKBH5 的表达影响恶性肿瘤进展[40]。

3.3 ALKBH5 调控NSCLC 细胞侵袭

过表达ALKBH5 可以抑制转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）诱导的EMT和NSCLC 细胞迁移、侵袭。ALKBH5 过表达可降低TGFβR2和SMAD 家族成员3（SMAD family member 3，SMAD3）的表达以及二者mRNA 的稳定性，同时增加SMAD6 的表达并增强其mRNA 稳定性，而敲低ALKBH5导致相反的结果。此外，m6A 结合蛋白YTHDF1/3 能够促进TGFβR2和SMAD3 表达，YTHDF2 能够抑制SMAD6 表达，YTHDF1/2/3 能够促进TGF-β刺激的EMT和NSCLC细胞增殖。在机制上，ALKBH5 通过擦除m6A 影响TGFβR2、SMAD3和SMAD6 的表达及mRNA 稳定性，从而修饰NSCLC 细胞。ALKBH5 削弱了YTHDF1/3 介导的TGFβR2和SMAD3mRNA 稳定，并抑制了YTHDF2介导的SMAD6mRNA 降解。综上所述，ALKBH5对调节TGF-β/SMAD 信号转导具有重要作用，ALKBH5 通过介导TGFβR2/SMAD3/SMAD6 信号通路抑制NSCLC中TGF-β诱导的EMT[41]。

3.4 ALKBH5 调控NSCLC 血管生成

PVT1 在体内和体外促进NSCLC 的进展，并调控肺癌中血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的表达和血管生成。敲低ALKBH5能够抑制NSCLC 的生长和转移。此外，敲低ALKBH5可以抑制NSCLC 的体内外血管生成。机制研究表明，敲低ALKBH5降低了PVT1在NSCLC 中的表达和稳定性[13]。

3.5 ALKBH5 与NSCLC 患者预后的关系

ALKBH5 在NSCLC 中表达升高，ALKBH5 表达升高与NSCLC 患者的预后不良相关。体外研究表明，敲低ALKBH5可抑制PC9 和A549 细胞的增殖能力，促进G1期停滞并显著增加凋亡细胞的比例。此外，ALKBH5 过表达会增加A549 细胞的增殖能力。敲低ALKBH5会增加周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）或组织金属蛋白酶抑制因子3（tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3）的表达。这些改变被ALKBH5 和IGF2BP 抵消[42]。由此可见，ALKBH5/IGF2BP 信号通路通过促进细胞增殖和致瘤性导致NSCLC 预后不良。

4 小结与展望

综上所述，NSCLC 是一种高度恶性肿瘤，临床发病率和病死率均较高。NSCLC 患者即使早期接受手术治疗，由于肿瘤细胞易转移和侵袭，患者的生存率也较低。因此，迫切需要找到一个可有效抑制NSCLC 细胞生长和转移的新靶点。目前ALKBH5在NSCLC 中的研究仍处于初级阶段，但ALKBH5修饰影响NSCLC 细胞侵袭、转移已经初步得到证实，其耐药机制尚未明确，未来可研发用于治疗NSCLC 的小分子抑制剂或纳米药物。虽然目前ALKBH5 在NSCLC 中的分子机制仍待进一步挖掘，但ALKBH5 可能为NSCLC 的治疗提供新的突破点并可能改变治疗效果及患者预后。