虾脊兰种子的组织培养技术

张玲 赵颖 叶波 高浩杰 孙圳

(舟山市林业科学研究院，浙江 舟山 316000)

野生植物是自然生态系统中的重要组成部分，是维持生物多样性的重要保障，是不可或缺的生物资源，一些野生植物的生存受到严重威胁，部分种类甚至灭绝由于人类的干扰活动不断加剧和全球气候变化。生物多样性是人类赖以生存和发展的基础。所以，保护野生植物及其赖以生存的自然环境是人类自身生存和发展的必要措施，亟需拯救濒临灭绝的物种。

虾脊兰(Calanthe discolor Lindl.)属兰科(Orchidaceae)虾脊兰属(Calanthe)多年生地生植物，《野生动植物濒危物种国际贸易公约》把兰科植物全科所有种类列入保护范围，是世界性濒危物种。在舟山主要分布在舟山岛、桃花岛、朱家尖岛、普陀山等岛屿，生于阔叶林下或灌丛中。虾脊兰既是观赏植物中的珍品，也有较高的医药用途，在开发利用上具有很高的价值。由于人为采挖和生境破坏，野生资源濒临枯竭，亟需加强扩繁保护。

目前，对受到威胁或已经濒危的中国野生植物，采取就地保护与迁地保护相结合的方法。野生植物保护区建设就是就地保护重点，野生植物在生态系统内进行恢复和扩繁需要受威胁植物的保护尽量结合其生境。将植物的种质资源保存在植物园就是迁地保护，建立种子库、基因库和相关研究机构的实验基地和实验室中保存。就地保护和迁地保护都是野生植物保护的基本措施。

21世纪人类面临的共同主题是维护生态安全，加强生态保护，促进生态文明。随着社会经济的发展，生态环境建设已经越来越受到各级政府和有关部门的重视。加强野生植物物种保护，特别是珍稀植物的保护和利用，是维护生态平衡，保障生态安全，实现生态文明的重要举措。适应海岛生境的虾脊兰不仅具有较高的园艺价值，而且在海岛生态中占有重要的地位，对其而进行保护和利用具有重要的现实意义，而保护的基础是种群数量，因此组培快繁是前提。

1 材料与方法

1.1 虾脊兰生物学、生态学特性

在舟山市朱家尖、桃花岛等地根据虾脊兰分布点的实际地形地势，采用样方法对虾脊兰所在群落进行群落特性调查。选择10m×10m的样方，统计每个样方内虾脊兰的数量、群落郁闭度、伴生植物、小地形等情况，分析虾脊兰所在群落的物种组成与结构等生态学特性。

1.2 试验材料的采集

8—9月于舟山朱家尖和桃花岛采集虾脊兰成熟未开裂的蒴果，用干净真空袋装好带回实验室放于3℃冰箱中冷藏备用。

1.3 试验方法

1.3.1 蒴果消毒

取成熟未开裂的虾脊兰蒴果洗净并吸干水分，有斑点的蒴果用手术刀轻轻刮掉，用75%酒精棉球擦拭多次后在超净工作台上风干表面水分，用无菌镊子和无菌手术刀将小种子在1个自制的小容器里挑选处理，容器上开口，下小细网，见图1，用镊子夹住容器用蒸馏水冲洗3～5次，用75%酒精浸泡30s。

图1 自制容器

种子酒精浸泡完成后用无菌水冲洗3～5次。把放有种子的容器放入1个无菌瓶中，并放入2%的次氯酸钠浸泡10min。消毒杀菌完毕再用无菌水反复冲洗3～5次。把容器放入无菌瓶内反复冲洗，无菌水沥干净备用。

1.3.2 种子诱导

前期试验根据前人研究表明，虾脊兰种子诱导以4/5MS、1/2MS及MS培养基，分别加入200ml·L-1椰汁、不同激素(0.025～0.1mg·L-16-BA，0.1mg·L-1NAA)和0.1g·L-1AC组合，并附加琼脂4.25g·L-1、蔗糖20g·L-1，pH值5.7，光照强度35μmL·m-2，光照时长12h，培养室温度控制在25±2℃，观察种子萌发情况。

萌发率(%)=诱导成功瓶数/接种瓶数×100

1.3.3 增殖与分化

将虾脊兰诱导原球茎接种在MS、1/2MS培养基上，分别加入100ml·L-1椰汁或者15g·L-1香蕉泥，添加不同激素配比(0.5～1mg·L-16-BA，0.25mg·L-1NAA)和0.25g·L-1AC组合，并附加琼脂4.25g·L-1、蔗糖30g·L-1，pH值5.8，培养室温度控制在25±2℃，光照强度40μmL·m-2，光照时长为12h，35d后统计结果。

增殖数=增殖的原球茎数/接种原球茎数

1.3.4 生根与壮苗

在虾脊兰培养瓶中选择长势良好且株高3cm以上虾脊兰进行生根试验。以MS培养基为基础，分别加入100ml·L-1椰汁或者20g·L-1香蕉泥，添加不同激素(0.25mg·L-1NAA)和0.5g·L-1AC组合，并附加琼脂4.25g·L-1、蔗糖30g·L-1，pH值5.8，培养室温度控制在25±2℃，光照强度40μmL·m-2，光照时长为12h，在90d后观察生根情况。

生根率(%)=(生根数/接种数)×100

2 结果与分析

2.1 种子诱导

虾脊兰种子萌发以激素浓度适宜在加了椰汁的培养基中，萌发效果较好，时间短，具体见表1，即在培养基A4：4/5MS加200mL·L-1椰汁加0.025mg·L-16-BA加0.05mg·L-1NAA加0.1mg·L-1AC，培养约120d后种子开始从乳白色小点转化为黄色，继续培养约30d左右以后，虾脊兰原球茎逐渐发育成淡绿色，超过85%萌发率，原球茎长势旺盛饱满，见图2。当6-BA浓度为0.1mg·L-1且不加椰汁的诱导率小于10%，并且出现较高比例的褐化现象。

表1 不同激素和有机组合诱导虾脊兰种子结果

图2 虾脊兰种子诱导

2.2 原球茎的增殖与分化

将虾脊兰原球茎转接至不同激素和天然复合物的组合中，天然的香蕉或者椰汁对细胞和组织的增殖分化起到明显的作用，见图3。原球茎在B3培养基中增殖速度较快，30d后即可形成虾脊兰小苗，具体见表2。当6-BA浓度较高时(1mg·L-1)，虾脊兰增殖系数较低，并出现褐化现象。

表2 不同培养基对虾脊兰原球茎增殖的影响

图3 虾脊兰原球茎增殖

2.3 虾脊兰生根

虾脊兰分化后的小苗接种到生根培养基中14d左右，小苗开始生根。半透明状接近白色的新根慢慢的颜色变深变成深绿色，后逐渐变长变粗，见图4。在未添加任何激素的C1培养基上，虾脊兰也有很高的生根率；添加了NAA结合香蕉泥或椰汁的培养基中生根效果更好可达100%，且粗壮、较长、植株健壮，具体见表3。

表3 不同培养基对虾脊兰生根的影响

图4 虾脊兰生根苗

2.4 炼苗和移栽

根据虾脊兰生物学特性和组培苗生长情况，当组培苗长至8cm，具2～4片叶且根系完整时即可移栽，进行闭瓶和开瓶驯化约10d左右。移栽前先将组培瓶闭口放至于温室中炼苗，让瓶内的苗逐渐适应室内环境，慢慢打开组培瓶，之后将虾脊兰组培苗取出来，先用自然水洗干净培养基凝胶，再用1000倍多菌灵水溶液浸苗8～15min，取出晾干后待种。进行盆栽试验1180株，基质选用等体积比的椰糠和河沙的混合基质，浇足定根水。管护中保持21℃以上温度，置于阴凉通风处栽培，在此期间不浇水，以利新根生长和防止病害发生，5周后移入室中栽培。栽种时要注意保湿和遮荫，成活后可适当追肥，移栽后需要柔光，注意植株保湿，成活率在90%以上。新叶和新根长出后可以按照常规兰花进行种苗管理。

3 讨论

根据王国明《舟山海岛种子植物》，通过海岛植物调查虾脊兰的生境，为虾脊兰组培试验提供了基础。培养基的成功优选参考曾宋君等对银带虾脊兰进行种子离体培养。采用虾脊兰种子，原球茎，完整植株途径的方法筛选出适宜的培养基，建立无菌播种快繁技术体系参考于罗远华等以三褶虾脊兰种子为外植体。胚柄细胞与内珠被紧密接触为其提供营养物质；而种子萌发困难的主要原因是内种皮营养物质和水分的运输在一定程度上的阻隔，连静静等发现，无距虾脊兰幼胚的发育过程属于石竹型提供了很好的借鉴。

兰花种子的萌发率与其种类和成熟度均有紧密关系，虾脊兰的种子极小，在自然条件下萌发率不超过10%。通过蒴果培养可以有效提高虾脊兰的快速繁殖，1个蒴果内含有种子多至数十万粒。目前，虾脊兰常采用块茎进行分株繁殖，但该种方法成活率较低。因此，运用种子无菌萌发与组培快繁技术对虾脊兰进行扩繁，同时通过虾脊兰迁地保护与回归等方式进行保护，缓解虾脊兰生存状况，以期为今后海岛珍稀植物保护等研究工作提供经验与帮助。

目前，组培技术很广泛地应用在兰科植物的生产和繁育上，如风兰、蝴蝶兰、大花蕙兰等兰花品种的组培技术已经非常成熟。虾脊兰采用成熟未破裂的种子为外植体进行组织培养，不仅能减少褐化，还易灭菌。6-BA和NAA的不同浓度组合对兰科植物种子萌发具有显著影响。本研究结果发现，在培养基中加入椰汁和降低琼脂的含量能有效提高种子的萌发、原球茎的增殖和分化、生根。因此，通过有机成分、激素、控制矿物质元素等条件，能给植物提供所需的生长营养成分。

4 结论

根据各样地调查，得知虾脊兰所在群落的物种组成与结构等生态学特性。虾脊兰，是兰科虾脊兰属植物。地生植物，高30～40cm，茎不明显。叶近基生，2～3枚，叶片狭倒卵状长圆形，先端急尖或钝而具短尖，基部楔形下延。花葶从当年新株的幼叶丛中长出，总状花序长5～15cm，有花数朵至10余朵；花紫红色开展；萼片近等长，中萼片卵状椭圆形，侧萼片狭卵状椭圆形；花瓣萼片较小，倒卵状匙形或倒卵状披针形，唇瓣玫瑰色或白色，与萼片近等长，与蕊柱合生，3裂，侧裂片斧状，中裂片卵状楔形，先端2裂，唇盘上具3条褶片；距圆筒形，细长，末端弯曲；蕊柱粗短。蒴果长圆柱形，下垂。花期一般在4—5月，果期8—10月。根状茎不是很明显，假鳞茎粗短，近圆锥形；耐半阴，较耐寒，不耐干旱，喜阳光充足温暖湿润的环境，喜疏松肥沃和排水良好的腐叶土或泥炭苔藓土，常生于海拔780～1500m的常绿阔叶林下。生于山坡林下，灌丛中，其周边具有代表性的乔木为红楠、柘树、普陀樟等；灌木为茶、朱砂根、天仙果等；草本植物为山蒟、络石、江南星蕨等。了解了虾脊兰的生物学和生态学特性给接下来对虾脊兰组培试验打下了基础。

本研究筛选得到虾脊兰种子萌发培养基，根据不同激素配比和有机添加物的组合，在虾脊兰诱导阶段，4/5MS加200mL·L-1椰汁加0.025mg·L-16-BA加0.05mg·L-1NAA加0.1mg·L-1AC加琼脂4.25g·L-1加蔗糖20g·L-1，虾脊兰诱导率达到85%以上。在虾脊兰增殖分化阶段，MS加100mL·L-1椰汁加0.5mg·L-16-BA加0.25mg·L-1NAA加0.25mg·L-1AC加琼脂4.25g·L-1加蔗糖30g·L-1增殖最快。在虾脊兰生根阶段，MS加100mL·L-1椰汁加0.25mg·L-1NAA加0.5mg·L-1AC加琼脂4.25g·L-1加蔗糖30g·L-1培养基中生根效果更好，可达100%，且粗壮，较长，植株健壮。培养条件为pH5.8，温度25±2℃，光照时长12h。从此试验得出，在每个阶段添加椰汁能有效提高虾脊兰的种子萌发，原球茎增殖分化和壮苗生根。根据虾脊兰原生地生境状况，选择生境相似的地点，模拟虾脊兰自然生长条件，运用迁地保护技术对虾脊兰进行保护，并结合就地保护、近地保护技术，选择原生地或近生地，对虾脊兰进行回归，调查与监测各保护地虾脊兰植株的存活和生长状况，制订保护措施。