暗培养时间对汕农幸运女神和汕农福星蝴蝶兰丛生芽增殖率的影响初探

王春丹 张秀珊 王健蓉 林天友 苏镇祥 陈桂玲 曾宝珰

(汕头市农业科学研究所，广东 汕头 515021)

蝴蝶兰(Phalaenopsis spp.)别名蝶兰，蝴蝶兰属热带或亚热带的单茎性气生兰，其花形似蝴蝶飞舞，色彩艳丽且颜色多样，有纯色的红、黄、白、绿、紫红、深红、粉红、橙红，也有白花黄心、黄花红心、紫花白边等。花朵的品种不同，花的大小也有差异。大花品种花朵甚至超过15cm，大小接近人的手掌，小花品种有的小于2cm，小巧玲珑。唇瓣的花色及形状变化也是十分丰富，极具观赏价值。有些花种不仅颜色美，花型好，更是带着淡淡的香味，让人喜爱。蝴蝶兰花期可长达数月，植株外型美观，素有“洋兰皇后”之称，与卡特兰、万代兰、石斛兰并称为4大观赏兰[1]。蝴蝶兰常野生于热带高温、多湿的中低海拔山林中，喜高温、多湿、散射光及通风良好的环境，忌闷热及强光。适宜的生长温度白天为25～28℃，晚间为18～20℃。温度高于35℃或低于10℃时，蝴蝶兰停止生长。昼夜温差最好达到5～8℃，有利于蝴蝶兰的生长。蝴蝶兰被视为“爱情、纯洁、美丽”的象征，一直以来在花卉市场备受欢迎，每年春节都能看到其身影。颜色美、株形好的蝴蝶兰备受宠爱，走入了千家万户。质量高、品质好的蝴蝶兰更是市场所需求的，这就对蝴蝶兰种苗的大规模生产起到推动作用。提高蝴蝶兰优良品种的繁殖速度，对培育大批量优质种苗意义重大，有利于进一步扩大生产规模。加强和完善蝴蝶兰离体培植技术体系的研究，可更好为其提供有力条件。

蝴蝶兰种子如灰尘，小而轻，没有胚乳。在自然条件下，种子的萌发率极低，无法利用播种方式有效繁殖，植株也很少发育侧芽，很难采用常规分株方式进行无性繁殖。蝴蝶兰组培选取带休眠芽的幼嫩花梗作为外植体诱导出不定芽，进而产生丛生芽，丛生芽经过增殖可直接成苗。蝴蝶兰丛生芽途径的优点，不仅仅是诱导率高，所用时间短，增殖率高，而且性状稳定，变异率低，可全年生产等，且所繁育的种苗能较好保持亲本的优良性状，能满足蝴蝶兰规模化生产的需求，因此已成为蝴蝶兰种苗生产最有效的手段[2]。

植物组织培养是以植物生理学为基础发展起来的一项技术。经过各国科学家多年探索，当前几乎所有的植物器官、组织或细胞都能离体培养成功[3]。目前，与蝴蝶兰组织培养技术研究方面相关的文献较多[4-8]，蝴蝶兰组培技术比较成熟，但不同品种之间的组培条件差异较大，这就要求对于组织培养技术方面研究要更为细化。有关暗培养对增殖率影响的研究少有报道。本文以汕头市农业科学研究所自主选育的蝴蝶兰优良新品种“汕农幸运女神”(粤评花20220007)、“汕农福星”(粤评花20220004)在继代阶段的丛生芽为材料，初步探索暗培养时间对“汕农幸运女神”“汕农福星”蝴蝶兰丛生芽继代增殖的影响，为现有的蝴蝶兰快速繁殖体系添砖加瓦，降低组培成本，为蝴蝶兰相关生产企业提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为汕头市农业科学研究所自主选育的“汕农幸运女神”“汕农福星”蝴蝶兰经丛生芽途径的继代材料。

1.2 方法

选取芽体生长基本一致的单芽，每瓶接种11个芽，培养基为1/2MS加6-BA 7mg·L-1加Ad 5mg·L-1加白糖20g·L-1加椰汁100mg·L-1加琼脂4g·L-1，pH5.8。

将接种后的材料进行暗培养，设7个处理，暗培养天数分别为0d(处理1)、10d(处理2)、20d(处理3)、30d(处理4)、40d(处理5)、50d(处理6)、60d(处理7)，每个处理设置3次重复，每个重复5瓶，共15瓶。在达到暗培养天数后转入培养温度为26±2℃、光照强度为2000～2500lx的培养室中培养。继代培养周期为60d，转瓶时记录每瓶芽数，计算每个处理每瓶平均芽数，计算平均增殖系数。

1.3 增殖系数计算

计算公式：

增殖系数=每瓶平均芽数/每瓶接种芽数

2 结果与分析

2.1 “汕农幸运女神”暗培养处理1～7丛生芽增殖情况

从图1可知，处理1单芽基部长出新的丛生芽，新芽叶色浓绿，芽体较粗壮，但新芽数量较少；处理2～5萌发的新芽呈翠绿色，芽数比处理1明显增加；处理6～7萌发的新芽呈嫩绿色，芽数比其它处理明显增加。光照时间长短不同，各个处理的蝴蝶兰苗颜色也略有差别，其中，处理6经过50d的暗培养，新芽的颜色偏白，虽有10d光照，颜色尚未恢复为绿色。处理7在无光照的条件下，叶片得不到足够的光照，不能形成叶绿素，使得新芽生长缓慢，芽体弱小，颜色偏白色，有的新芽更是略透明，但新芽数量最多，见图2，之前所接的单芽和新生芽形成一簇，紧密相挨。

注：图片编码A1～A7分别对应不同暗培养天数。

图2 处理7(暗培养60d)

2.2 “汕农幸运女神”“汕农福星”经过不同暗培养天数后丛生芽的增殖情况

从表1、表2可知，随着暗培养天数的增加，2个品种的增殖系数随着增大，见图3。当材料暗培养至60d时，增殖系数最高，“汕农幸运女神”增殖系数达到6.73，而“汕农福星”的增殖系数达到5.81。

表1 不同暗培养天数“汕农幸运女神”丛生芽增殖情况

表2 不同暗培养天数“汕农福星”丛生芽增殖情况

图3 “汕农幸运女神”和“汕农福星”增殖系数折线图

3 讨论与结论

目前，蝴蝶兰组织培养研究大多采用原球茎途径[9，11]，相比原球茎途径，丛生芽的报道较少。丛生芽的组织培养途径诱导率高，性状稳定，同时所用时间短，节约了时间成本，蝴蝶兰丛生芽的组织培养途径的增殖率高，可达3～6倍，相比其他，技术难度低，性状稳定，这就避免了变异的产生，对大规模的生产意义重大。

组织培养是蝴蝶兰快速繁殖的主要途径，在合理高效利用有限外植体的前提下，提高蝴蝶兰不定芽的增殖率就可以提高蝴蝶兰的繁殖速度。从试验结果来看，通过增加暗培养时间明显提高“汕农幸运女神”“汕农福星”不定芽的增殖率。在单一个继代周期内，随着暗培养天数的增加增殖率逐渐提高，见图3，经过60d暗培养供试2个品种的丛生芽增殖率最高，达到6.73和5.81。从供试的2个品种试验结果来看，暗培养天数在20～40d，增殖系数已达到4.14～6.01倍的较高水平，所以选择暗培养天数为20～40d是较合适的。考虑到蝴蝶兰组培苗的继代周期一般为50～60d，如果暗培养的天数达到50d和60d时，新萌发的芽体较为嫩绿，虽然增殖的新芽多，但没有经过光照培养，芽体较小，相对较弱，有的甚至出现玻璃化，在下一次继代转瓶初期又再一次进行暗培养，长时间处于暗培养至第2次继代转瓶时不排除会出现黄化或死芽情况，不利于正常增殖生长。所以，在本试验中不将增殖率较高的暗培养天数50d和60d列为合适处理方法。在1个继代周期内，适当增加暗培养的天数，明显有利于提高丛生芽增殖率。

影响蝴蝶兰组织快速繁殖的因素有很多，包括蝴蝶兰品种的不同、基础培养基的选择、外植体不同、消毒方式不同、调节物质及添加量的不同、还有光照条件、温度、湿度等培养条件的不同等。本文为暗培养时间对蝴蝶兰丛生芽增殖影响的初步探索，旨在为蝴蝶兰品种扩繁增殖阶段科学暗培养提供参考，具体应用指导生产还有待进一步深入探索。此次试验仅针对特定品种“汕农幸运女神”“汕农福星”所得出的结论，而不同蝴蝶兰之间存在品种差异，对培养基和培养条件的要求也不同，具体品种的合适暗培养时间有待进一步探索；在设置暗培养时间上，本文以10d为间距，如缩短为5d间距，进一步观察暗培养时间对蝴蝶兰丛生芽的影响，更有利于准确掌握不同品种的适宜暗培养时间；此次试验仅在单一个继代周期内进行，对其后续多代转瓶情况仍未了解，连续几个继代周期(3代以上)进行试验，并观察对其以后生长如促根或移栽阶段的影响，才能科学总结具体品种的暗培养需求；暗培养与褐变的关系。褐变现象是指在组织培养过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也慢慢变褐而死亡的现象培养。外植体褐变是植物组织培养中遇到的重要问题。与褐变的相关研究表明，光照强度与褐变程度之间存在一定关系。如，许传俊等通过培养基及光照对蝴蝶兰叶片外植体褐变的影响试验结果表明，光照强度增加，外植体褐变也严重[12]；赵伶俐等研究了不同光照强度培养下，蝴蝶兰初代培养过程中外体内多酚氧化酶(PPO)活性、总酚含量以及褐化百分率的变化规律[13]，也表明了光照强度与褐化程度之间的关系。那么，如何通过科学的暗培养减轻褐化程度有待于进一步深入探讨研究，科学总结研究结果。

暗培养时间与蝴蝶兰丛生芽增殖关系，此次试验仅为初探，受品种、培养基、培养条件等相关条件所限制，未能进一步全面探究，对于暗培养时间对蝴蝶兰丛生芽的影响将有待进一步探索研究，为现有的蝴蝶兰快速繁殖体系添砖加瓦，降低组培成本，以提高经济效益。