桑椹胚移植在体外受精-胚胎移植中的临床应用

孙庆云,王 跃,朱序理,周 亮,杜元杰,曹金凤,郝桂敏

(河北医科大学第二医院生殖医学科,石家庄 050000)

自1978年第一例试管婴儿诞生以来,体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transform,IVF-ET)技术取得了重大进展,但目前仍存在一些问题,其中最令人担忧的是较高的多胎妊娠率及其造成的不良围产结局[1-2]。大部分辅助生殖中心目前仍以移植两枚卵裂期胚胎移植为主,多胎率得不到有效的控制。近年一些中心尝试进行单囊胚移植,多胎率显著降低,但培养囊胚的成功率约为50%[3-4],增加了周期取消率。目前关于D4桑椹胚移植的报道较少,D4桑椹胚的选择仍缺乏较为客观、准确的方法,尚未达成共识,如何选择最具活力和潜能的胚胎进行D4胚胎移植,以减少移植胚胎的数量,同时提高胚胎的着床能力,是一个极具挑战性的问题。本文通过分析IVF-ET周期中D4桑椹胚移植的临床结局,以探讨桑椹胚移植的选择策略和可行性,以期更好地指导临床工作。

1 资料与方法

1.1 研究资料 回顾分析2013年1月至2021年12月在河北医科大学第二医院生殖医学中心行IVF/ICSI-ET D3和D4新鲜周期移植的患者的临床资料。纳入标准:(1)新鲜周期D3和D4移植患者;(2)移植胚胎数≤2枚。排除标准:(1)女方输卵管积水或宫腔积液而未行处理的患者;(2)夫妇一方或双方染色体核型异常。倾向性评分(PSM):符合纳入标准的周期中D4移植组205周期,D3移植共22762周期,使用PSM进行匹配,以女方年龄、不孕因素、不孕年限、周期数、获卵数、移植胚胎数、移植年份和月份为匹配条件,Caliper设为0.2、1∶4匹配D3移植组820周期。

1.2 方法

1.2.1 体外受精与胚胎培养 采用常规促排卵方案,取卵日超声引导下经阴道穿刺取卵。取卵日男方手淫法取精,依据精液情况使用常规IVF或卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)方法授精,授精后第一天将受精卵转移至卵裂期培养液(G-1plus,Vitrolife,瑞典)进行常规胚胎培养及观察,第3天(D3)观察胚胎情况并将可利用胚胎转移至囊胚培养液(G-2plus,Vitrolife,瑞典)继续培养至第4天(D4)。

1.2.2 胚胎评分 第3日卵裂期胚胎评价依据Gardner标准[5]。第4日胚胎依据Istanbul共识[6]将分为3级:1级:发生第四次有丝分裂,且胚胎细胞整体发生致密化;2级:发生第四次有丝分裂,胚胎细胞大部分发生致密化;3级:大部分的胚胎细胞未发生致密化。

1.2.3 胚胎移植和黄体支持 胚胎培养至D3或D4择优移植,移植胚胎数≤2枚。移植后行常规黄体支持:肌肉注射黄体酮(浙江仙琚制药)60mg/d或8%黄体酮缓释凝胶阴道给药(雪诺同,默克,英国)1次/d。B超检查见心管搏动后逐渐减量至停止。

1.2.4 临床妊娠诊断标准 患者胚胎移植后14～15d,检查尿妊娠试验阳性或血β-HCG≥10U/L为HCG阳性;胚胎移植后28～30d超声检查可见孕囊及心管搏动者为临床妊娠。

1.2.5 观察指标 记录两组的临床妊娠率(临床妊娠周期数/移植周期数×100%)、胚胎种植率(种植胚胎数/移植胚胎数×100%)、流产率(流产周期数/妊娠周期数×100%)、活产率(活产周期数/移植周期数×100%)以及出生缺陷率(出生缺陷胎儿数/出生胎儿总数×100%)。

2 结 果

2.1 D3、D4移植患者匹配前后基础情况比较 匹配后D3、D4移植两组患者女方年龄、BMI、bFSH、AMH及HCG日子宫内膜厚度比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 D3、D4移植两组患者匹配前后基础情况比较

2.2 匹配后D3、D4移植两组患者妊娠结局比较 匹配后D3、D4移植两组的临床妊娠率、种植率、多胎率、异位妊娠率、流产率、活产率以及出生缺陷率比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 匹配后D3、D4移植两组患者妊娠结局比较

2.3 匹配后不同年龄及有无冷冻胚胎D3、D4移植患者妊娠结局比较 按女方年龄分为<38岁和≥38岁两个亚组,再按移植后有无冷冻胚胎进一步分组,结果显示不论女方年龄<38岁还是≥38岁,移植后有冷冻胚胎患者的临床妊娠率、种植率和活产率均高于无冷冻胚胎患者,但D3、D4组的临床妊娠率、种植率和活产率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 匹配后不同年龄有无冷冻胚胎D3、D4移植患者妊娠结局比较

2.4 不同年龄和周期数D3、D4移植单胚胎患者妊娠结局比较 在单胚胎移植周期中,不论女方年龄<38岁还是≥38岁,D4移植患者的临床妊娠率和活产率较D3移植患者均有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。按助孕次数分组,结果显示不论助孕周期数≤2或≥3周期,D4移植患者的临床妊娠率和活产率较D3移植患者均有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),见表4。

表4 不同年龄和周期数单胚胎D3、D4移植患者妊娠结局比较

2.5 D4移植桑椹胚评级不同患者妊娠结局比较 按D4移植的桑椹胚评级将患者分为四组:移植D4两枚3级桑椹胚、移植D4两枚1～2级桑椹胚、移植D4一枚3级桑椹胚、移植D4一枚1～2级桑椹胚。患者移植两枚D4桑椹胚时,移植1～2级桑椹胚组的种植率显著高于移植3级桑椹胚患者,差异有统计学意义(P<0.05),但临床妊娠率和多胎率比较差异无统计学意义(P>0.05)。移植一枚D4桑椹胚时,移植1～2级桑椹胚组的临床妊娠率、种植率和活产率均高于移植3级桑椹胚的患者,差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 D4不同评级桑椹胚及移植双胚、单胚患者妊娠结局比较

2.6 D4 1～2级单桑椹胚移植和D5/D6单囊胚移植患者妊娠结局比较 选取2020至2021年于我院行IVF/ICSI-ET助孕新鲜周期D5/D6移植单囊胚的患者共90周期,与D4移植一枚1～2级桑椹胚的周期进行比较,两组的临床妊娠率和活产率差异均无统计学意义(P>0.05),见表6。

表6 D41～2级单桑椹胚移植和D5/D6单囊胚移植患者妊娠结局比较

3 讨 论

辅助生殖现在的治疗目标是单胎妊娠,选择最具种植潜能的单个胚胎进行移植,以实现健康的单胎妊娠足月分娩。由于在IVF/ICSI-ET后避免多胎妊娠的全球共识日益增加,因此在改良胚胎选择的前提下,选择性单胚胎移植已被推广[7-9],以达到维持妊娠率和降低多胎妊娠率的风险。桑椹胚是受精卵连续分裂,卵裂球数量迅速增加而单个细胞体积越来越小,细胞排列紧密,是受精后72h形成的形似桑椹的实心胚胎。根据伊斯坦布尔共识将桑椹胚分为3级,1～3级桑椹胚的主要区别在于其发生致密化的程度不同,发生致密化后的桑椹胚各细胞之间的界限不再清晰,整个胚胎像一个大细胞,有的桑椹胚部分细胞呈月牙形、梭形且细胞间出现小腔隙,从而形成初期囊胚,也叫早期囊胚。

D4桑椹胚移植较D3卵裂期胚胎移植有一定的优越性:(1)桑椹胚的形成跨越了卵裂期胚胎发育停滞现象[10-11],度过了母源基因调控期,启动了合子基因组激活[12-13],是胚胎发育潜能的进一步优选;(2)自然妊娠条件下人类胚胎在精卵结合后第4天进入子宫腔,所以D4桑椹胚移植比D3卵裂期移植更接近自然情况;(3)尽管目前胚胎培养条件逐步改善,培养体系不断革新,但是囊胚形成率仍未得到有效提高,与囊胚移植相比,D4桑椹胚移植缩短了体外培养时间,减少了体外培养对表观遗传学的干扰[14-15],而且已有报道结果显示D4桑椹胚移植与囊胚移植具有相似的妊娠率[16-17]。

3.1 D3和D4移植患者总的临床妊娠结局比较 D3和D4移植患者组的临床妊娠率、种植率、多胎率、异位妊娠率、流产率、活产率和出生缺陷率比较,差异均无统计学意义。本中心D4移植有一部分患者为非选择性D4胚胎移植,这部分患者由于D3胚胎质量较差而选择继续培养至D4移植,或因获卵数较少D4移植时没有多余的胚胎可供选择,使得D4移植的临床妊娠率和种植率与D3相比没有显著提高。

3.2 不同年龄的D3和D4移植患者妊娠结局 <38岁患者有剩余冷冻胚胎组的临床妊娠率、种植率和活产率都较高,这部分患者年龄小,胚胎质量好,我中心数据这部分患者D4移植种植率为44.0%。这组患者建议选择D4移植一枚桑椹胚,在保证临床妊娠率的前提下更好地降低多胎妊娠的发生。但<38岁无剩余冷冻胚胎组的临床妊娠率、种植率较低,提示即使患者较年轻,对于部分胚胎质量差的患者不管D3或D4移植其妊娠结局都是不佳的。在≥38岁时,不管是否有剩余胚胎冷冻,D4移植较D3移植都有较高的临床妊娠率、种植率和活产率,尤其≥38岁且无冷冻胚胎组最显著。本文中D4和D3移植临床妊娠率分别为24.0%和11.5%、种植率分别为19.1%和9.7%、活产率分别为20%和8%,差异虽无统计学意义,但D4移植有明显增高趋势。文献报道,女性年龄小于39岁时,D4冻融胚胎移植可获得较好的妊娠率和活产率[18]。以上数据提示在患者胚胎质量好或差、胚胎数量多或少时,都可D4进行桑椹胚移植以对胚胎进行进一步筛选,提高患者的临床妊娠率和种植率,但仍需增加样本量做进一步的验证。

3.3 不同年龄单胚胎D4和D3移植患者妊娠结局 由于D3和D4移植一枚胚胎的患者都存在部分为非选择性单胚胎移植,两组患者的临床妊娠率和活产率无统计学差异,但是D4移植临床妊娠率和活产率都有增高趋势,这个趋势在≤2周期患者中更明显,所以这部分患者建议选择D4单桑椹胚移植,以更好地保证临床妊娠率降低多胎率。而在≥3周期的患者中,不管是D3或D4移植单枚胚胎其临床妊娠率都是较低的,考虑到这部分患者存在反复种植失败的问题,可在与患者充分沟通的情况下选择移植两枚胚胎或采取序贯移植的策略以改善患者的妊娠结局[19]。

3.4 D4不同评级桑椹胚移植患者的妊娠结局 本研究结果显示,移植两枚1～2级桑椹胚较移植两枚3级桑椹胚有更高的临床妊娠率和种植率,但两组的多胎率均较高,移植一枚1～2级桑椹胚其临床妊娠率和活产率显著高于移植一枚3级桑椹胚。因此,建议D4选择性移植评级较高的1～2级桑椹胚一枚,可在保证临床妊娠率的同时显著降低多胎率[20-21]。另外,即使移植两枚D4评分为3级的桑椹胚,仍有较高的双胎妊娠率,如患者助孕≤2周期、D3胚胎数≥4枚,这时可考虑进一步培养囊胚再做选择。本文资料由于部分患者为非选择性胚胎移植,需要后期加大样本量严格设计进一步研究。

3.5 D4 1～2级单桑椹胚移植和D5/D6单囊胚移植患者妊娠结局比较 本研究结果显示,桑椹胚和囊胚移植的临床妊娠率和活产率均无显著差异,这与前期报道结果相似[22]。D4移植可在保证临床妊娠率和活产率的前提下减少至少24h的体外培养时间,在一定程度上减轻了患者的焦虑,节省了人力和物力。本文资料由于部分患者为非选择性胚胎移植,需要后期加大样本量严格设计进一步研究。

综上所述,在IVF临床实践中D4桑椹胚移植的策略是可行的,其增加了胚胎选择方案是移植策略的有效补充,方便患者和工作安排;优质的单桑椹胚胎移植在保证较好的临床妊娠率和活产率的前提下降低多胎率;桑椹胚移植既对胚胎进行了优选又缩短了胚胎在体外的培养时间。