前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)在大脑中作用及与卒中关系

田竺，胡群亮

人类前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin，PCSK9)基因位于染色体1p32.3上，血浆中PCSK9主要由肝细胞分泌，并以活性和非活性的形式存在于血浆中[1]。PCSK9活性形式由全长异二聚体组成，该异二聚体主要与低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)颗粒相关，无活性的异二聚体占总循环15%～40%[2]。长期以来PCSK9在调节血浆低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及其在家族性高胆固醇血症中研究较多[3-4]。但在2003年，在原代小脑神经元中首次发现PCSK9在细胞凋亡过程中上调的mRNA[5]。

PCSK9最突出的作用是它与肝脏中的低密度脂蛋白受体(LDL receptor，LDLR)的相互作用，它还与LDL 受体相关蛋白1(LDL receptor-related protein 1，LRP1)和B类清道夫受体CD36结合[6-7]。LRP1是一种细胞膜上的大型内吞受体，参与脂质稳态、细胞内信号传导和Aβ肽的清除，它在肝脏中的肝细胞和脑中的血管细胞、神经元和星形胶质细胞中均可表达。CD36参与原纤维Aβ介导的小胶质细胞活化和氧化LDL摄取，PCSK9水平升高刺激巨噬细胞中CD36的表达。在大脑中，PCSK9与几种将胆固醇运输到神经元的受体相互作用，包括LDLR、极低密度脂蛋白受体和载脂蛋白E受体2(apolipoprotein E receptor 2，ApoER2)[8]。

近年来逐渐证实了PCSK9在中枢神经系统中的重要作用[9-10]。尽管大脑是体内胆固醇含量最高的器官，几乎占人体总胆固醇的25%，但其胆固醇的合成和稳态维持独立于其他器官和组织。胆固醇和PCSK9在正常条件下都不会穿过血脑屏障。但在不同疾病状态下，由于血脑屏障通透性改变和血管破裂可能导致影响大脑内胆固醇稳态。脑脊液中的PCSK9的平均浓度为5 ng/mL，并在24 h内保持稳定水平，而血清PCSK9平均浓度存在一定昼夜浓度变化，可由下午183 ng/mL到凌晨升高到552 ng/mL[11]。大脑中的胆固醇代谢和稳态维持独立于外周血液系统。基于此，本文综述了PCSK9在神经系统中的生理作用及与卒中的关系。

1 P CS K9在大脑中的作用

1.1 神经元分化 PCSK9在包括肝细胞肾间充质细胞和脑神经元细胞等有增殖能力的细胞中高表达[12]。在发育过程中，在斑马鱼的神经发生开始时及小鼠端脑和小脑神经发生期间即可检测到PCSK9。成年后，PCSK9仅在斑马鱼的皮层、颅内和小脑颗粒神经元等区域以及小鼠部分延髓区域表达[13]。PCSK9可通过驱动神经元分化促进神经发生，在小鼠胚胎神经祖细胞中发现，PCSK9的过度表达导致有丝分裂后神经元数量增加，同时未分化神经上皮细胞数量减少[5]。

PCSK9在神经元分化的机制作用可能与其在LDLR代谢中的机制作用无关。在小鼠P19胚胎癌细胞中，维甲酸诱导的神经外胚层内源性PCSK9 mRNA水平增加了7倍，但LDLR蛋白水平保持恒定[14]。

此外，神经发生过程中PCSK9的表达不受参与胆固醇调节的转录因子的控制。在肝脏中，PCSK9转录被固醇调节元件结合蛋白2(SREBP-2)高度上调，SREBP-2是一种膜结合转录因子，可激活编码参与胆固醇合成的酶的基因表达。与PCSK9不同，维甲酸不会改变SREBP-2 mRNA的表达，这表明这些神经外胚层细胞衍生物中PCSK9表达的增加受到与其他胆固醇生成器官(如肝脏)中PCSK9表达不同的机制的调节[15]。

1.2 LDL受体家族代谢 PCSK9通过促进LDL受体家族的溶酶体降解来增加发育中大脑的胆固醇水平。这些受体结合脑中的主要胆固醇载体载脂蛋白E(apoE)，并将apoE 结合的胆固醇从细胞周围液转运到神经元中，从而降低胆固醇水平。在PCSK9 基因敲除小鼠的大小端脑和小脑的LDLR蛋白水平显著高于野生型小鼠，apoE水平降低约25%[13]。

成年小鼠的体外和体内关于大脑中PCSK9是否靶向LDLR，VLDLR和ApoER2降解之间的研究结果目前仍存在一定矛盾。如与未加入PCSK9的空白对照组相比，加入PCSK9共培养的人胚胎肾细胞293(HEK293细胞)的LDLR、VLDLR、ApoER2受体蛋白水平显著降低[16]。而在PCSK9基因敲除的成年小鼠中发现，尽管PCSK9和LDLR mRNA在延髓中共定位，但与野生型小鼠相比，延髓或脑脊液中的LDLR和ApoE蛋白水平没有显著差异[13]。此外，PCSK9的过表达或缺失并不影响成年小鼠大脑海马体和脑皮质中的LDLR、VLDLR 或ApoER2水平[16]。

成人大脑中体外和体内结果之间的差异一方面原因是PCSK9在胆固醇调节中的作用具有一定细胞或组织特异性，另一方面可能由于成年时期内源性PCSK9 浓度远低于发育过程中的浓度，PCSK9水平的变化不足以改变受体水平。例如，与野生型小鼠相比，在大鼠大脑中动脉短暂性闭塞模型诱发的缺血性卒中后病变侧齿状回的PCSK9表达显著增加。尽管缺血性卒中后野生型和PCSK9基因敲除小鼠的LDLR蛋白水平均降低，但PCSK9基因敲除小鼠的LDLR水平降低更多，降低幅度达到了50%，这也提示PCSK9对于LDLR降解是必需的[13]。上述这些发现表明PCSK9可调节成年大脑中LDLR水平，但PCSK9水平变化仅在大脑发生卒中等显著病理改变时才可能被检测到。

1.3 细胞凋亡 最初PCSK9在神经细胞凋亡细胞模型中发现，但随后的研究显示PCSK9同时具有促凋亡和抗凋亡作用。

PCSK9可促进缺钾小脑颗粒神经元的凋亡，PCSK9的过表达也可诱导细胞死亡，而PCSK9的沉默限制细胞死亡。此外，PCSK9在包括星形孢菌素(STS)诱导的缺钾小脑颗粒神经元和神经生长因子剥夺的背根神经节神经元等其他凋亡模型中也证实了其具有促凋亡特征[17]。在人神经胶质瘤U251 细胞中发现，沉默PCSK9 后细胞表现出凋亡特征，包括细胞收缩，膜完整性丧失，核碎裂和染色质压缩，而PCSK9过表达的细胞具有正常形态[18]。提示PCSK9可促进神经胶质瘤U251细胞的存活。

目前已经证实，PCSK9可通过外在和内在的凋亡途径促进细胞死亡，并且可能通过JNK途径发挥作用[19]。在缺钾小脑颗粒神经元模型中，被RNA干扰(RNAi)抑制的具有PCSK9的缺钾小脑颗粒神经元细胞具有较低水平的磷酸化的c-Jun和切割的半胱天冬酶-3(caspase-3)两种促凋亡蛋白，其中磷酸化的c-Jun是JNK依赖性细胞凋亡所必需的，而切割的caspase-3是参与细胞凋亡的重要分子。有趣的是，ApoER2已被证明可通过对JNK途径失活来促进神经元存活。与对照细胞相比，被RNAi抑制的具有PCSK9的缺钾小脑颗粒神经元细胞中的ApoER2水平增加了41%。而缺钾小脑颗粒神经元细胞中ApoER2水平降低导致先前较低水平的切割的caspase-3增加，表明PCSK9至少部分通过控制ApoER2水平而介导细胞凋亡[20]。在星形孢菌素诱导的缺钾小脑颗粒神经元细胞凋亡模型中，RNA干扰PCSK9后降低了神经元细胞中caspase-3的活化，但对磷酸化c-Jun活性没有影响，表明PCSK9 也可能通过JNK非依赖性途径促进细胞凋亡[20]。

此外，PCSK9还通过内在或线粒体凋亡途径介导神经胶质瘤U251细胞存活。PCSK9小干扰RNA(siRNA)增加促凋亡蛋白caspase-3的活化，下调抗凋亡蛋白如XIAP和p-Akt，并增加Bax/Bcl-2的比例，导致细胞色素c释放增加从线粒体进入细胞质。PCSK9过表达具有相反的作用，减少切割的caspase-3水平，Bax/Bcl-2的比例和细胞色素c释放的量，并增加细胞中存在的XIAP 和p-Akt 的含量[18]。虽然PCSK9调节细胞凋亡的途径已经阐明，但PCSK9改变途径中不同蛋白质浓度水平的确切机制仍不清楚，需要更多的研究来确定PCSK9是直接作用于这些蛋白质还是通过下游作用信号通路的影响。

与LDLR代谢相似，在体内未证实上述体外研究结果。在心脏缺血/再灌注损伤(左前降支冠状动脉结扎术)之前，期间或之后施用PCSK9抑制剂(PCSK9i)Prep2-8三氟乙酸盐不影响通过TUNEL测定法测量的凋亡细胞的百分比和大鼠脑中Bax和Bcl-2的水平[21]。此外，在小鼠中动脉阻塞实验后的海马梗死或半影中未观察到PCSK9 mRNA表达，这表明PCSK9在啮齿动物模型的神经元死亡中没有显著作用[13]。

1.4 神经炎症 最近研究表明PCSK9可能促进神经炎症[21-22]。心脏缺血/再灌注损伤的大鼠模型显示p-NFκB/NFκB水平升高以及星形胶质细胞和小胶质细胞的活化。静脉内施用PCSK9抑制剂Prep2-8三氟乙酸盐显著降低p-NFκB表达并减少由心脏缺血/再灌注损伤诱导的反应性小胶质细胞和星形胶质细胞增殖和肥大。有趣的是，PCSK9抑制剂并未降低大脑中PCSK9的水平，这表明PCSK9抑制剂并未穿过血脑屏障，也未直接作用于大脑。这些结果提示抑制PCSK9表达可降低血清PCSK9水平、降低炎症状态，以减少大脑内炎症水平。PCSK9也可能通过控制LDLR和apoE水平参与局部神经炎症。在BV2小胶质细胞和人THP-1单核细胞中的研究发现apoE和apoE模拟物通过与LDLR相互作用降低LPS介导的TNF-α和IL-6分泌以及p44/42MAPK，JAK2和STAT3磷酸化[23]。当然今后仍需要更多的研究来确定PCSK9在控制大脑炎症和免疫方面中的全身和局部作用。

2 P CS K9与卒中

啮齿动物研究显示短暂性大脑中动脉闭塞后PCSK9 mRNA 水平上调以模拟缺血性卒中[12]。PCSK9 mRNA表达在齿状回中增加，但在梗死或半影中未增加，表明PCSK9在缺血性卒中后的神经元凋亡中不起作用。在短暂性大脑中动脉闭塞后野生型和PCSK9 基因敲除小鼠海马中发现LDLR蛋白水平均降低，但PCSK9基因敲除小鼠降低50%，提示PCSK9促进缺血性卒中后LDLR代谢。对由心脏缺血/再灌注损伤诱导的大鼠脑损伤的研究表明，PCSK9抑制显著减少了损伤后反应性星形胶质细胞和小胶质细胞的数量，表明PCSK9也参与神经炎症[12]。

人类的遗传研究报告了缺血性卒中风险与PCSK9 基因中几个功能获得性(gain-of-function，GOF)突变之间的关联，这些突变导致血浆LDL-C升高。如研究显示，rs2479408和rs1711503 GOF变异与408例汉族脑缺血性卒中患者和348例非汉族对照者的脑缺血性卒中显著相关。rs505151(E670G)GOF 突变与同一人群的缺血性卒中风险无关[24]；然而，对同一基因变异的另外两项研究确实发现了突变与卒中发病率之间的关联[25]。比利时卒中研究(BSS)分析了237名中欧小血管闭塞或大血管动脉粥样硬化(LVA)的rs505151(E670G)GOF突变，发现该基因变异与血浆LDL-C水平升高，冠状动脉粥样硬化和LVA卒中的风险显著相关[26]。

PCSK9 基因中的大多数功能丧失(loss of function，LOF)变异与缺血性卒中风险无关。著名的ARIC动脉粥样硬化研究在15年间跟踪了3 363例黑人受试者(其中2.6%存在PCSK9突变)和9 524例白人受试者(3.2%存在PCSK9突变)，并未发现PCSK9 LOF Y142X或C679X变异与受试者间卒中发生率存在差异[27]。同样在对8个观察队列和一项他汀类药物治疗随机试验的Meta分析发现，在具有相同LOF变异的患者中，PCSK9突变与卒中发病率之间没有关联[28]。在161例汉族缺血性卒中患者和483例匹配对照中，rs11583680 LOF变异与缺血性卒中或其亚型的风险无关[29]。而对功能丧失rs11591147(R46L)PCSK9变异的几项研究Meta分析也发现与缺血性卒中和缺血性卒中亚型无关。有趣的是，来自英国生物库的337 536 个个体的PCSK9 LOF变体rs11591147(R46L，G/T)的孟德尔随机研究发现T等位基因在假设驱动组中对缺血性卒中具有保护作用，并且与卒中具有名义上显著的相关性[30]。虽然大多数研究表明PCSK9 LOF变异与缺血性卒中发病率无关，但由于卒中的测量和分类不同，研究人群之间的差异以及研究之间统计分析方法的差异，研究结果也有所不同。

虽然低PCSK9和LDL-C水平可能不会降低基线卒中风险，但可以肯定的是PCSK9抑制剂有助于降低高胆固醇和心血管疾病高风险患者的卒中发病率。一项荟萃分析得出结论，所有降胆固醇治疗均降低了患者的卒中风险，因为降低循环胆固醇水平可降低动脉粥样硬化和栓塞血栓的风险[31]。针对PCSK9的单克隆抗体evolocumab的干预对卒中效果的研究显示，与接受安慰剂组相比，接受evolocumab药物的组中卒中显著减少，而他汀类药物组与安慰剂组结果并无统计学差异[32]。然而，PCSK9抑制剂的其他分析发现与卒中减少无关。著名的长期评估低密度脂蛋白胆固醇的开放性研究(OSLER 研究和ODYSSEY LONG TERM研究) 表明，evolocumab和alirocumab在高心血管风险的高胆固醇血症患者中的长期安全性和耐受性及对短暂性脑缺血发作、卒中发生率并无显著影响[33]。但上述两个研究时间相对较短，研究时间分别为1年和1.5年，今后需要更长时间的研究来充分评估evolocumab和alirocumab对此类患者卒中发病率的影响。

出血性脑卒中发病率相对较少，针对此类患者的遗传学研究也相对较少，而研究观察到PCSK9与出血性卒中间并无关联。对23项研究的Meta分析发现，低LDL-C水平与出血性卒中有关，但理论上可能是由于患者总体健康状况不佳，而不是PCSK9或低LDL-C的致病作用[28]。

3 总结及展望

尽管PCSK9 在肝脏中的作用已得到充分研究，但PCSK9在大脑中的作用仍不清楚。但关于PCSK9在神经系统中的作用也越来越多。PCSK9参与神经祖细胞向神经元的分化，LDLR家族中受体靶向溶酶体降解，神经元凋亡的调节以及大脑中星形胶质细胞和小胶质细胞的活化。在细胞系、动物模型和遗传研究也揭示了PCSK9在缺血性卒中中的作用。关于PCSK9是否直接对大脑有局部作用还是通过对外周组织的全身作用再影响大脑是今后需要进一步研究的问题，同样尚不清楚PCSK9是否通过升高血浆LDL-C水平对炎症产生全身作用，或者PCSK9是否也在大脑局部中起作用以控制炎症。对PCSK9单克隆抗体的全身性和局部性脑效应研究，以及这些抗体在脑卒中等不同中枢神经疾病中能否或在多大程度上可以穿过血脑屏障都是今后值得探索的话题。