单宁酸与不同配比头孢哌酮钠/舒巴坦钠对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的体外抑菌作用研究

欧阳龙, 肖亚雄

(1. 川北医学院 医学检验系, 四川 南充, 637000; 2. 四川省宜宾市第一人民医院, 四川 宜宾, 644000;3. 四川省宜宾市中医医院, 四川 宜宾, 644000)

鲍曼不动杆菌属于非发酵革兰氏阴性杆菌,是一种广泛分布于临床的机会致病菌。中国细菌耐药监测网发布数据显示,鲍曼不动杆菌在2010年就已超过铜绿假单胞菌,成为医院感染最主要的非发酵菌。随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用,鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率从2005年的31.0%和39.0%上升到2021年的71.5%和72.3%[1]。目前临床尚无明确针对耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌(CRAB)感染的“标准抗菌药物方案”,美国传染病学会专家小组建议尽可能使用至少2种活性抗菌药物联合治疗中重度CRAB感染[2]。近年来研究[3]表明,很多中药活性成分具有良好的抗菌作用,与临床常见抗生素联用能起到减量增效的作用,具有巨大的开发潜力。

单宁酸是一种多酚化合物,广泛存在于五倍子、石榴、茶叶等天然植物中。研究[4]表明,单宁酸对金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌等9种临床常见分离菌株有一定抗菌作用,对多重耐药菌株和非多重耐药菌株的抗菌活性无显著差异,提示或可使用单宁酸治疗临床多重耐药细菌感染。《中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识》[5]认为,头孢哌酮与舒巴坦在体外对不动杆菌存在协同抗菌活性,敏感性优于氨苄西林/舒巴坦,可作为不动杆菌感染的主要治疗药物。头孢哌酮钠/舒巴坦钠为头孢哌酮和舒巴坦的复方制剂,临床中有头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶ 1)和头孢哌酮钠/舒巴坦钠(2∶ 1)这2种不同配比的制剂。本研究通过体外试验比较不同配比的头孢哌酮钠/舒巴坦钠对CRAB的抑菌作用,并对单宁酸与头孢哌酮钠/舒巴坦钠进行联合药敏试验观察抑菌作用,以期为单宁酸与头孢哌酮钠/舒巴坦钠联合治疗CRAB感染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌株来源: 收集2022年宜宾市第一人民医院检验科微生物室分离的6株CRAB,标本类型分别为血液、尿液、脓液、分泌物、痰液、脑脊液。鲍曼不动杆菌对任何一种碳青霉烯类药物耐药,即判定为CRAB菌株。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853, 购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2 试剂与材料: 单宁酸(西格玛奥德里奇贸易有限公司),头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶ 1)(辉瑞制药有限公司),头孢哌酮钠/舒巴坦钠(2∶ 1)(辉瑞制药有限公司), MH琼脂平板(郑州安图生物工程股份有限公司), MH肉汤(青岛海博生物技术有限公司),无菌96孔板(比克曼生物科技有限公司)。

1.1.3 仪器: 生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司),超低温医用冰箱(青岛海尔特种电器有限公司),电热恒温培养箱(上海力新仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液配置: 将所有CRAB菌株接种于MH琼脂平板,35 ℃培养20 h,挑取数个分离纯化后的菌落置于生理盐水试管中,使用比浊仪校正浓度至0.5麦氏单位(1.0×108cfu/mL)。

1.2.2 微量肉汤法测定最低抑菌浓度(MIC): 用MH肉汤配制头孢哌酮钠/舒巴坦钠和单宁酸储存液,浓度为1 024 μg/mL。对以上浓度药物进行一系列的倍比稀释,终浓度分别为1 024、512、256、128、64、32、16、8 μg/mL,再将稀释至不同浓度的药液100 μL加入96孔板中,最后加入已配制菌液100 μL。将MH肉汤作为空白对照,不含抗菌药物的菌悬液作为阳性对照。35 ℃培养24 h后,观察单宁酸与不同配比头孢哌酮钠/舒巴坦钠对6株CRAB的MIC,并记录结果。

1.2.3 联合用药的部分抑菌浓度指数(FICI)测定: 选取抑菌效果更好的头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶ 1)与单宁酸进行联合抑菌试验。取无菌96孔板,横排标为A～H,纵列标为1～8,将单宁酸与头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶ 1)分别倍比稀释至受试菌4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32 MIC这8个稀释度,以棋盘微量肉汤法测定2种药物联用的MIC。A～H横排依次为单宁酸MIC的4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍, 1～8纵列依次为头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶ 1)MIC的4、2、1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍。每种药物各取50 μL, 两两组合加入96孔板指定孔内,各孔内加入100 μL用MH肉汤稀释至浓度为1×106cfu/mL的菌悬液,使得体系内单宁酸与头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶ 1)的药物浓度分别为1 MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC、1/128 MIC。使体系内菌悬液浓度为5×105cfu/mL, 加样完成后振荡混匀,每批进行空白对照、生长对照。将96孔板置于35 ℃恒温培养箱内静置培养24 h后观察结果,观察各孔浑浊度并记录2种药物联用时的MIC值。

1.2.4 结果判定: 根据药物单用和联用的MIC, 参照文献[6] 计算FICI。FICI=甲药联用MIC/甲药单用MIC+乙药联用MIC/乙药单用MIC。FICI≤0.5时,2种药为协同作用; FICI>0.5～1.0时, 2种药为相加作用; FICI>1.0～4.0时, 2种药为无关作用; FICI>4.0时, 2种药为拮抗作用。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 MIC测定结果

单宁酸对6株CRAB的MIC范围为128～256 μg/mL, 平均MIC为(213.3±66.1) μg/mL; 头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶ 1)对6株CRAB的MIC范围为32～128 μg/mL,平均MIC为(90.7±42.5) μg/mL; 头孢哌酮钠/舒巴坦钠(2∶ 1)对6株CRAB的MIC范围为64～256 μg/mL, 平均MIC为(181.3±85.1) μg/mL, 高于头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶ 1),差异有统计学意义(P<0.05), 见表1。由此提示,头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶ 1)的抑菌效果更好,故后续选用头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶ 1)与单宁酸进行联合抑菌试验。

表1 3种抗菌药物对6株CRAB的MIC结果(n=3)

2.2 单宁酸与头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶ 1)联合抑菌效果

单宁酸与头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶ 1)联合用药对6株CRAB的FICI范围为0.375～0.750, 除AB04菌株表现为协同作用,其余菌株均表现为相加作用,见表2。由此表明,单宁酸可增强头孢哌酮钠/舒巴坦钠对CRAB的抑菌作用。

表2 单宁酸与头孢哌酮钠/舒巴坦钠联用对6株CRAB的抑菌效果(n=3)

3 讨 论

鲍曼不动杆菌是医院感染较为常见的条件致病菌,是最常见的多重耐药病原菌"ESKAPE"成员之一。随着CRAB感染率的不断增高,患者的治疗费用和病死率显著增加[7-8]。目前, CRAB的治疗方案多为基于舒巴坦、多黏菌素、替加环素的联合用药[5]。注射用多黏菌素价格昂贵,且具有明显的肾毒性[9]和神经毒性[10]。相对于多黏菌素而言,替加环素肾毒性较低,但其在微生物清除方面效果较差[11-12]。舒巴坦复合制剂是目前使用较为广泛的抗CRAB药物,其中头孢哌酮钠/舒巴坦钠是一种广谱抗生素,主要被用于治疗CRAB等革兰氏阴性菌引起的感染。头孢哌酮钠/舒巴坦钠的主要成分是头孢哌酮和舒巴坦,其中头孢哌酮属于第3代头孢菌素类药物,具有广谱抗菌作用,而舒巴坦属于β-内酰胺酶抑制剂,能够增强头孢哌酮的抗菌活性。该复方制剂已被广泛应用于临床,且在治疗医院感染方面表现出显著的抗菌效果。

目前,市场上有头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶1)和头孢哌酮钠/舒巴坦钠(2∶1)这2种配比的制剂可供选用,为探究不同配比头孢哌酮钠/舒巴坦钠对CRAB的体外抗菌活性,本研究挑选6株具有代表性的临床菌株进行体外试验。本研究发现,头孢哌酮钠/舒巴坦钠(2∶1)对6株CRAB临床菌株的MIC值均是头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶1)的2倍。由此推测,舒巴坦的浓度可能在头孢哌酮钠/舒巴坦钠复方制剂对CRAB的抗菌作用中起主导作用,即舒巴坦浓度越高,复方制剂对CRAB的抗菌作用越强。LAI C C等[13]也发现,在头孢哌酮中加入舒巴坦可提高头孢哌酮对CRAB的体外抗菌活性,头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶1)的半数抑菌浓度(MIC50)和90%抑菌浓度(MIC90)均低于头孢哌酮钠/舒巴坦钠(2∶1)。尽管上述试验提示头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶1)对CRAB的体外抗菌活性优于头孢哌酮钠/舒巴坦钠(2∶1), 但根据中国细菌耐药监测网技术方案中头孢哌酮钠/舒巴坦钠对不动杆菌属折点判定标准,本实验中6株试验菌株对头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶1)依然均应判定为耐药。因此,本研究根据中西药联用可增强药物抑菌效果并逆转细菌耐药性的思路[14], 对单宁酸和头孢哌酮钠/舒巴坦钠进行联合用药试验,观察其对CRAB的抑菌作用。本研究结果显示,与单药相比,两者联合用药的抑菌效果明显增强,其中5株菌株表现为相加作用, AB04菌株则表现为协同作用[联合用药后头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶1)的MIC由原来的64 μg/mL降至16 μg/mL, MIC降到敏感水平]。

综上所述,头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶1)在体外对CRAB的抗菌活性优于头孢哌酮钠/舒巴坦钠(2∶1), 单宁酸与头孢哌酮钠/舒巴坦钠(1∶1)联用具有协同和相加作用,能够降低头孢哌酮钠/舒巴坦钠对CRAB的MIC。但本研究纳入菌株数量较少,且仅纳入对碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌,不能证明药物对不同耐药性的鲍曼不动杆菌均有良好抗菌作用,后续将扩大样本量开展更深入的研究。此外,本研究仅观察到单宁酸与头孢哌酮钠/舒巴坦钠联合干预下头孢哌酮钠/舒巴坦钠对CRAB的MIC明显下降,但未深入研究其作用机制,未来应进一步探索联合用药的抑菌作用机制,从而为抗CRAB感染提供更全面的理论基础。