无花果内生菌Alternaria sp.QDFB-2发酵液的聚酮类化学成分研究

孙 丽, 王莎莎, 陈春颖, 赵 雪, 王凤舞, 申 丽

(1. 扬州大学医学院, 江苏 扬州, 225001;2. 江苏省中西医结合老年病防治重点实验室, 江苏 扬州, 225001;3. 青岛农业大学食品科学与工程学院, 山东 青岛, 266109)

无花果(FicuscaricaL.)为桑科榕属无花果亚属植物,是一种药食同源的植物。据《全国中草药汇编》和《中华本草》记载,无花果性平、味甘,具有润肺止咳、清热润肠功效,主治咳喘、肠炎、腹泻、便秘、痔疮等。研究[1]显示,丰富的化学成分是无花果具有抗氧化、提高机体免疫力、延缓衰老等作用的物质基础。目前,无花果的叶片、果实、乳浆及树脂中已被发现不少新活性成分,基于内共生理论,其内生菌值得关注。马养民等[2-3]曾对无花果内生菌进行较为深入的研究,并分离纯化获得2个新化合物。从A.tamariiFR02中分离得到的新环五肽malformin E具有显著的体外抑菌活性,其对Staphylococcusaureus、EscherichiaColi、PseudomonasAeruginosa、CandidaAlbicans、Fusariumsolani和Penicilliumchrysogenum的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.45、0.91、1.82、7.24、7.24和3.62 μmol/L; malformin E还对人乳腺癌细胞株MCF-7和人非小细胞肺癌细胞株A549具有较强的细胞毒活性,半抑制浓度(IC50)分别为0.65和2.42 μmol/L, 与阳性对照药阿霉素(IC50分别为1.24和4.28 μmol/L)相当[2]。从Fusariumsp.FL10中分离得到的新化合物helvolic acid methyl ester对P.Aeruginosa和E.Coli的MIC分别为3.13和6.25 μg/mL[3]。无花果内生真菌能产生结构新颖、活性多样的次生代谢产物,是微生物药物的潜在来源。Alternariasp.QDFB-2是从无花果枝条中分离得到的一种内生真菌,本研究采用硅胶柱、Sephadex LH-20凝胶柱、ODS反相柱和高效液相色谱法(HPLC)等方法对其GPY培养基发酵液的化学成分进行分离纯化,并利用核磁共振谱(NMR)、高分辨质谱(HR-MS)等现代波谱技术和文献比对方法鉴定化合物结构,共获得7个聚酮类化合物,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 材料与试剂: 柱层析硅胶(200～300目),青岛海洋化工厂分厂; Sephadex LH-20填料,瑞典Pharmacia Biotech公司; Silica gel 60 F254铝板(20 cm×20 cm), 德国默克集团; Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×200.0 mm, 5 μm)、Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm)和Betasil C18柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm), 大连依利特分析仪器有限公司; DMSO-d6, 美国Cambridge Isotope Laboratories; CDCl3和acetone-d6, 美国ALDRICH公司; CD3OD, 青岛腾龙微波技术有限公司; 色谱甲醇,瑞典欧森巴克环保化学公司; 人宫颈癌细胞株HeLa和人肝癌细胞株SMMC-7721, 美国ATCC公司; 顺铂(Cisplatin), 江苏豪森药业股份有限公司; 四甲基偶氮唑蓝(MTT), 北京索莱宝科技有限公司; DMEM培养基,美国Gibco公司; 胎牛血清,美国Gemini公司; 0.25%胰蛋白酶,上海碧云天生物有限公司; 其他试剂为分析纯。

1.1.2 仪器: AVANCE 400和AVANCE 600核磁共振仪,德国Bruker公司; Agilent 6530 Q-TOF液-质联用仪,美国安捷伦科技公司; TripleTOF 4600 UPLC-Q-TOF-MS液-质联用仪,美国AB SCIEX有限公司; LC3000N高效液相色谱仪,北京创新通恒色谱技术有限公司; Isolera one快速制备液相色谱,瑞典Biotage公司; UPT-Ⅱ-10T超纯水仪,四川优普超纯科技有限公司; SHP-250恒温培养箱,上海精宏实验设备有限公司; Bio-Tek SYNERGY2酶标仪,美国BioTek有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验菌株: 菌株QDFB-2是王凤舞博士从无花果枝条中分离得到的内生真菌,菌株的分离和纯化参照文献[12]方法进行。菌株现保存于青岛农业大学食品科学与工程学院。

1.2.2 菌株的鉴定[13-14]: 将菌株接种至PD培养基中培养3～5 d, 按照试剂盒说明书提取DNA。采用通用引物(ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′; ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增转录间隔区(ITS)序列,扩增产物经凝胶电泳检测后测序,将测得的ITS序列上传至GenBank中进行Blast比对分析,用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

1.2.3 菌株的发酵和发酵产物的提取[13-14]:Alternariasp. QDFB-2采用GPY培养基(葡萄糖15 g、胰蛋白胨3 g、酵母膏1 g、水1 000 mL)进行液体静置发酵。将菌株从冻存管接种到PDA平板培养2～3 d, 然后挑取新鲜菌块接种到500 mL三角瓶(200 mL PDB培养基)中, 28 ℃、120转/min培养2～3 d; 种子液以每瓶2.5%的接种量接种到1 000 mL三角瓶(400 mL GPY培养基)中,室温静置培养28 d。发酵液经乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液并减压去除溶剂得到粗浸膏26.44 g。

1.2.4 发酵产物的分离纯化: 发酵液粗浸膏经硅胶柱分离, CH2Cl2-CH3OH进行梯度洗脱(v/v100∶0→0∶100), 再经薄层色谱(TLC)合并得到19个组分(Fr.1～Fr.19)。组分Fr.5经Sephadex LH-20凝胶柱层析分离得到Fr.5-1～Fr.5-3, 其中Fr.5-3经HPLC[Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm), 254 nm, CH3OH∶H2O(v/v)为50∶50, 1 mL/min]分离纯化得到化合物2[1.0 mg, 保留时间(tR)=19 min]。组分Fr.8经硅胶柱分离得到Fr.8-1～Fr.8-3, 其中Fr.8-1经Sephadex LH-20凝胶柱进一步分离得到Fr.8-1-1～Fr.8-1-4, Fr.8-1-2再经HPLC[Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm), 254 nm, CH3OH∶H2O(v/v)为40∶60, 1 mL/min]分离纯化得到化合物1(2.5 mg,tR=19 min), Fr.8-1-4再经HPLC[Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm), 254 nm, CH3OH∶H2O(v/v)为55∶45, 1 mL/min]分离纯化得到化合物3(1 mg,tR=51 min)。组分Fr.11经Sephadex LH-20凝胶柱分离得到的Fr.11-1再经HPLC[Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×200.0 mm, 5 μm), 254 nm, CH3OH∶H2O(v/v)为55∶45, 1 mL/min]分离纯化得到化合物4(8.0 mg,tR=21 min)和化合物5(3.2 mg,tR=23 min); Fr.11-2经HPLC[Sinochrom ODS-AP柱(4.6 mm×200.0 mm, 5 μm), 210 nm, CH3CN∶H2O(v/v)为25∶75, 1 mL/min]分离纯化得到化合物7(4.2 mg,tR=39 min)。组分Fr.11-3经HPLC[Betasil C18柱(4.6 mm×150.0 mm, 5 μm), 254 nm, CH3OH∶H2O(v/v)为39∶61, 1 mL/min]分离纯化得到化合物6(6.1 mg,tR=60 min)。

1.2.5 体外细胞毒活性测定: 参照文献[15], 采用MTT法测定化合物对人宫颈癌细胞株HeLa和人肝癌细胞株SMMC-7721的体外细胞毒活性。阳性对照药为顺铂。

2 结 果

2.1 菌株鉴定

将菌株QDFB-2的ITS序列上传至美国国立生物技术信息中心(NCBI)的Genbank数据库中进行Blast比对分析,并构建系统发育树。菌株QDFB-2被鉴定为Alternariasp. (GenBank登录号: MZ359821), 见图1。

图1 Alternaria sp. QDFB-2的系统发育树

2.2 化合物的结构鉴定

从Alternariasp. QDFB-2发酵液乙酸乙酯粗浸膏中分离得到7个聚酮类化合物,分别为7-hydroxy-2, 5-dimethyl-4H-1-benzopyran-4-one(1)[4]、1-deoxyrubralactone(2)[5]、alternariol-9-O-monomethyl ether(3)[6]、alternariol(4)[7]、altenuisol(5)[8]、stemphyperylenol(6)[9]和altertoxin Ⅰ(7)[10-11], 其结构式见图2。

图2 7个聚酮类化合物的化学结构式

化合物1: 白色粉末,分子式为C11H10O3。HR-ESI-MSm/z: 191.070 2 [M+H]+, 213.052 3 [M+Na]+(C11H10O3Na理论值为213.052 2);1H-NMR(600 MHz, CD3OD)δH: 6.54 (1H, d,J=1.8 Hz, H-6), 6.53 (1H, d,J=1.8 Hz, H-8), 5.90 (1H, s, H-3), 2.61 (3H, s, H-2′), 2.22 (3H, s, H-5′);13C-NMR(150 MHz, CD3OD)δC: 182.4 (C-4), 166.7 (C-2), 163.1 (C-9), 161.4 (C-7), 143.6 (C-5), 118.0 (C-6), 115.6 (C-10), 111.4 (C-3), 101.9 (C-8), 23.1 (C-5′), 19.8 (C-2′)。以上1H-NMR和13C-NMR数据与文献[4]结果一致,故鉴定其为7-hydroxy-2,5-dimethyl-4H-1-benzopyran-4-one。

化合物2: 黄色粉末,分子式为C14H12O5。HR-ESI-MSm/z: 261.079 0 [M+H]+,283.050 0

[M+Na]+(C14H12O5Na理论值为283.057 7);1H-NMR(400 MHz, CDCl3)δH: 11.35 (1H, s, 6-OH), 6.70 (1H, d,J=2.4 Hz, H-7), 6.69 (1H, d,J=2.4 Hz, H-9), 3.94 (3H, s, H-11), 3.43 (1H, m, H-1), 2.92 (1H, dd,J=18.8, 6.4 Hz, H-2), 2.31 (1H, dd,J=18.8, 1.2 Hz, H-2), 1.46 (3H, d,J=7.2 Hz, H-1′);13C-NMR(100 MHz, CDCl3)δC: 195.3 (C-3), 166.8 (C-8), 165.3 (C-6), 164.9 (C-5), 148.2 (C-3), 144.6 (C-10), 134.5 (C-9), 103.2 (C-7), 103.0 (C-9), 100.8 (C-5), 56.0 (C-11)。以上1H-NMR和13C-NMR数据与文献[5]结果一致,故鉴定其为1-deoxyrubralactone。

化合物3: 黄色粉末,分子式为C15H12O5。HR-ESI-MSm/z: 273.076 3 [M+H]+, 295.057 3 [M+Na]+(C15H12O5Na理论值为295.058 2);1H-NMR(400 MHz, acetone-d6)δH: 7.31 (1H, d,J=2.0 Hz, H-10), 6.81 (1H, d,J=2.8 Hz, H-2), 6.71 (1H, d,J=2.8 Hz, H-4), 6.57 (1H, d,J=2.4 Hz, H-8), 3.98 (3H, s, H-12), 2.82 (3H, s, H-11);13C-NMR(100 MHz, acetone-d6)δC: 166.6 (C-9), 158.8 (C-3), 153.3 (C-4), 138.7 (C-10), 138.3 (C-1), 117.7 (C-2), 109.8 (C-10), 101.8 (C-4), 103.5 (C-10), 98.9 (C-8), 55.3 (C-12)。以上1H-NMR和13C-NMR数据与文献[6]结果一致,故鉴定其为alternariol-9-O-monomethyl ether(AME)。

化合物4: 白色结晶,分子式为C14H10O5。HR-ESI-MSm/z: 259.059 3 [M+H]+, 281.042 8 [M+Na]+(C14H11O5理论值为259.060 1);1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δH: 11.75 (1H, s, -OH), 7.21 (1H, d,J=1.2 Hz, H-6), 6.70 (1H, d,J=2 Hz, H-5′), 6.62 (1H, d,J=2.4 Hz, H-3′), 6.32 (1H, d,J=1.2 Hz, H-4), 2.69 (3H, s, H-8)。以上1H-NMR数据与文献[7]结果一致,故鉴定其为alternariol。

化合物5: 绿色粉末,分子式为C14H10O6。HR-ESI-MSm/z: 275.054 8 [M+H]+, 297.035 9 [M+Na]+(C14H11O6理论值为275.055);1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δH: 7.52 (1H, s, H-6′), 7.02 (1H, s, H-6), 6.75 (1H, s, H-3′), 6.52 (1H, s, H-4), 3.93 (3H, s, H-8′)。以上1H-NMR数据与文献[8]结果一致,故鉴定其为altenuisol(altertenuol)。

化合物6: 黄色粉末,分子式为C20H16O6。HR-ESI-MSm/z: 353.103 6 [M+H]+, 375.084 3 [M+Na]+(C20H17O6理论值为353.102);1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δH: 12.03 (2H, s, 4-OH, 10-OH), 8.02 (2H, d,J=8.8 Hz, H-6, H-12), 6.87 (2H, d,J=8.4 Hz, H-5, H-11), 5.77 (2H, s, 1-OH, 7-OH), 4.61 (2H, m, H-1, H-7), 3.73 (2H, d,J=8.8 Hz, H-6b, H-12b), 3.16 (2H, dd,J=15.6, 12 Hz, H-2, H-8), 2.93 (2H, dd,J=15.6, 4.4 Hz, H-2, H-8);13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δC: 203.5 (C-3, C-9), 159.2 (C-4, C-10), 142.9 (C-3b, C-9b), 134.6 (C-6, C-12), 130.0 (C-6a, C-12a), 114.9 (C-3a, C-9a), 114.5 (C-5, C-11), 66.5 (C-1, C-7), 46.9 (C-2, C-8), 44.6 (C-6b, C-12b)。以上1H-NMR和13C-NMR数据与文献[9]结果一致,故鉴定其为stemphyperylenol。

化合物7: 黄色粉末,分子式为C20H16O6。HR-ESI-MSm/z: 353.103 0 [M+H]+, 375.083 9 [M+Na]+(C20H17O6理论值为353.102);1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)δH: 12.73 (1H, s, 3-OH), 12.32 (1H, s, 10-OH), 8.07 (1H, d,J=8.8 Hz, H-1), 8.0 (1H, d,J=8.8 Hz, H-12), 7.05 (1H, d,J=8.8 Hz, H-2), 6.95 (1H, d,J=8.8 Hz, H-11), 5.37 (1H, s, 7-OH), 5.28 (1H, d,J=5.6 Hz, 6a-OH), 4.54 (1H, m, H-7), 3.02 (4H, m, H-5, H-6, H-6b, H-8), 2.86 (1H, dd,J=15.6, 4.8 Hz, H-8), 2.58 (1H, m, H-5), 2.31 (1H, td,J=14.4, 3.6 Hz, H-6);13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δC: 206.1 (C-4), 204.2 (C-9), 161.0 (C-3), 160.4 (C-10), 140.7 (C-9b), 138.4 (C-3b), 132.9 (C-1), 132.5 (C-12), 124.8 (C-12a), 123.5 (C-12b), 117.9 (C-2), 116.5 (C-9a), 115.5 (C-11), 113.8 (C-3a), 68.0 (C-6a), 64.6 (C-7), 51.4 (C-6b), 47.5 (C-8), 34.8 (C-6), 33.5 (C-5)。以上1H-NMR和13C-NMR数据与文献[10-11]结果一致,故鉴定其为altertoxin Ⅰ。

2.3 化合物的体外细胞毒活性

MTT法测定结果显示,化合物4对人宫颈癌细胞株HeLa和人肝癌细胞株SMMC-7721具有显著的增殖抑制活性, IC50分别为13.43和50.47 μg/mL, 而阳性对照药顺铂的IC50分别为8.71和3.46 μg/mL。

3 讨 论

植物内生菌是一种宝贵的微生物药物资源,药用植物内生菌是其中的重要研究方向之一。近年来,研究者们已从多种传统药用植物(如丹参、三七、雷公藤、人参、白芨等)的内生菌中发现多个结构新颖、活性显著的化学成分,为新药研制提供了丰富的先导化合物。WANG X Z等[16]从丹参内生真菌A.tenuissimaSP-07中分离得到的新化合物solanapyrones P对产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)和芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)具有显著的抗菌活性, MIC均为50 μg/mL。王献等[17]从白芨内生菌Ilyonectriarobusta中分离得到的新化合物butyl((S)-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)-D-leucinate对人乳腺癌细胞株MCF-7具有一定的增殖抑制活性, IC50为36.2 μmol/L。作为一种药食同源的植物,无花果极具药用价值和营养价值,其内生菌值得关注,但目前国内外关于无花果内生菌的研究较少。

Alternaria属真菌次生代谢产物种类丰富,主要包括肽类、生物碱类、聚酮类、tricycloalternarene(TCA)类和酚类等,其中不少成分具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、酶活性抑制等药理活性[18]。聚酮类化合物是天然产物中的一大类,是由聚酮合酶(PKS)催化生物合成的次生代谢产物,其来源广泛、种类繁多。目前,链格孢属真菌产生的聚酮类化合物主要为苯丙素类、吡喃酮类和苝醌类等[19-20]。本研究从无花果内生真菌Alternariasp.QDFB-2的发酵液中分离得到7个聚酮类化合物,其中化合物1～5为吡喃酮类,化合物6和化合物7为苝醌类; 化合物4(alternariol)对HeLa细胞和SMMC-7721细胞具有显著的增殖抑制活性, IC50分别为13.43和50.47 μg/mL, 其药理活性有待进一步研究。

随着基因组学和生物信息学的快速发展,科学家们发现链格孢属真菌存在着巨大的生物合成潜力,可以产生大量具有生物活性的次级代谢产物[21]。然而,常规培养条件下,微生物的许多合成基因簇处于沉默状态。研究[22]发现,微生物培养条件的微小变化可以改变其次生代谢特性,激活沉默的生物合成基因簇,提高微量次生代谢产物的产量或次生代谢产生新结构分子。单菌多次级代谢产物(OSMAC)策略是通过改变菌株的培养条件,如培养基组成(碳源、氮源、水、前体物质等)、pH值、温度、供氧水平、培养时间等,从而影响菌株次生代谢产物的种类和数量,以获得结构更丰富、活性更显著的次级代谢产物[23]。本课题组后续将基于OSMAC策略,对菌株QDFB-2的发酵条件进行优化,以期挖掘发现更多活性显著的天然产物,为新药研发提供先导化合物。