细胞蜡块与液基制片技术对细胞学样本ICC染色的比较研究
2023-09-20蒋丽娟唐福婷景红霞
蒋丽娟 唐福婷 景红霞
1南京医科大学附属妇产医院 南京市妇幼保健院病理科,南京 210004;2南京中医药大学附属医院 江苏省中医院病理科,南京 210029;3南京医科大学附属江宁医院病理科,南京 210000
细胞蜡块与液基制片技术提高了细胞学肿瘤诊断的准确性[1-2]。目前,大多运用细胞蜡块或液基制片技术行免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)染色协助病理医生诊断,但是少有文献比较细胞蜡块切片与液基涂片两种不同的细胞学制片技术对ICC结果的影响[3]。本文收集50例诊断为肺腺癌患者的癌性胸水标本,比较角蛋白7(cytokeratin 7,CK7)、上皮特异性抗原(MOC-31)、天冬氨酸蛋白酶A(Napsin-A)及甲状腺转录因子(thyroid transcription factor-1,TTF-1)4种抗体在胸水细胞蜡块切片与液基涂片上的免疫染色差异,探讨这两种细胞学技术对细胞学样本ICC结果的影响,为病理医生选择不同载体的ICC染色提供依据。
资料与方法
1.材料
回顾性分析江苏省中医院2022年1月至12月诊断为肺腺癌的50例胸水样本。选择MOC-31、Napsin-A、CK7及TTF-1 4种抗体,分别在胸水细胞蜡块切片及液基涂片上行4种抗体的ICC染色。
2.方法
2.1.胸水液基涂片的制作 取50 ml胸水于离心管,1 000 r/min离心5 min,去上清液,吸取细胞沉渣置于新柏氏非妇科液基保存液试剂瓶,静置15 min后,用Thinpre 2 000液基制片机(美国豪洛捷公司)制作5张液基涂片,立即95%乙醇固定15 min,1张行巴氏染色,其余4张75℃烤片15 min,备ICC染色。
2.2.胸水细胞蜡块切片的制作 取50 ml胸水于离心管,1 000 r/min离心5 min后去上清液后,加入10 ml 4%中性福尔马林,固定30 min后再次1 000 r/min离心5 min,加入1%融化后的琼脂糖,细胞沉渣凝固后放入组织包埋盒,常规脱水、包埋、3 μm切片、备ICC染色。
3.ICC染色
应用EnVision二步法原理,采用全自动免疫组化机(DAK0公司Omnis平台)进行染色。对细胞蜡块切片及液基涂片分别行MOC-31、Napsin-A、CK7及TTF-1免疫染色,4种即用型一抗均购自北京中衫金桥公司,同时设立阴性及阳性对照。MOC-31与CK7阳性信号定位于肿瘤细胞膜,Napsin-A定位于肿瘤细胞浆,TTF-1定位于肿瘤细胞核,免疫染色结果根据整张切片及液基涂片中的肿瘤染色强度分为阴性(无染色)、弱阳性(浅黄色)、强阳性(深黄色及棕色),弱阳性与强阳性表达判读为阳性表达。
4.统计学方法
所有数据采用SPSS 19.0统计软件,定性数据结果运用χ2检验,不满足χ2检验的数据,采用Fisher确切概率法,P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.细胞蜡块切片及免疫染色结果
细胞蜡块切片中腺癌细胞呈腺管样或小簇状,细胞核重度异型,呈空泡核,核膜增厚,可见核仁,核浆比高(图1A)。ICC染色细胞蜡块切片免疫染色结果,33例TTF-1强阳性表达,10例弱阳性表达(图1B),7例阴性表达;40例MOC-31强阳性表达,10例弱阳性表达(图1C);28例Napsin-A强阳性表达,14例弱阳性表达(图1D),8例阴性表达;46例CK7强阳性表达,4例弱阳性表达。
图1 细胞蜡块切片及液基涂片肺腺癌细胞免疫染色表达的差异。A:细胞蜡块切片,肿瘤细胞呈单个、小簇状排列(HE染色 ×200);B:细胞蜡块切片,肺腺癌细胞细胞核TTF-1弱阳性表达(ICC染色 ×200);C:细胞蜡块切片,肺腺癌细胞细胞膜MOC-31弱阳性表达(ICC染色 ×200);D:细胞蜡块切片,肺腺癌细胞细胞浆Napsin-A弱阳性表达(ICC染色 ×200);E:液基涂片,肿瘤细胞呈三维立体排列,肿瘤细胞细胞浆稀少,具有高核浆比(巴氏染色 ×200);F:液基涂片,肺腺癌细胞细胞核TTF-1强阳性表达,肿瘤细胞的高核浆比,导致胞浆不明显(ICC染色 ×200);G:液基涂片,肺腺癌细胞细胞膜MOC-31强阳性表达,因肿瘤细胞呈三维立体排列,胞膜的染色遮盖住细胞核(ICC染色 ×200);H:液基涂片,肺腺癌细胞细胞浆Napsin-A强阳性表达,胞浆的染色遮盖住细胞核(ICC染色 ×200)
2.液基涂片免疫染色结果
液基涂片中腺癌细胞呈三维立体状(图1E),细胞核重度异型,染色质深染,核膜增厚,核浆比高,可见增大的核仁,部分胞浆可见胞浆黏液空泡。44例TTF-1强阳性表达(图1F),2例弱阳性表达,4例阴性表达;50例MOC-31强阳性表达(图1G);40例Napsin-A强阳性表达(图1H),5例弱阳性表达,5例阴性表达;50例CK7强阳性表达。
3.比较4种抗体在液基涂片及细胞蜡块切片中阳性表达率和强阳性率
CK7与MOC-31在细胞蜡块切片与液基涂片上的阳性表达率均为100%,两者无差异,Napsin-A与TTF-1的阳性表达率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05),见表1。MOC-31、Napsin-A及TTF-1的细胞蜡块切片与液基涂片强阳性表达率比较,差异均有统计学意义(P<0.05),CK7的细胞蜡块切片与液基涂片强阳性表达率差异无统计学意义,见表2。
表1 4种抗体在液基涂片及细胞蜡块切片中阳性表达率比较 [%(例)]
表2 4种抗体在液基涂片及细胞蜡块强阳性率比较[%(例)]
讨论
细胞蜡块技术是近年发展起来的一项新的储存细胞的技术[4-5]。其主要原理是将细胞学样本离心,富集细胞后经4%中性甲醛固定,获得细胞沉渣后再行脱水、石蜡包埋,制作成细胞蜡块,制作流程和常规组织基本一样。因此,细胞蜡块切片行免疫细胞染色会出现福尔马林导致的抗原封闭现象,导致抗原不表达或表达变弱[6-7]。本研究中选择的4个抗体,CK7与MOC-31两个抗体表达于肺腺癌的细胞膜,Napsin-A表达于肺腺癌的细胞浆,TTF-1表达于肺腺癌的细胞核,在细胞蜡块与液基涂片阳性表达率的比较中,4种定位于不同细胞部位抗体的阳性表达率差异均无统计学意义[8-13]。因此,两种细胞存储技术对于浆膜腔积液细胞的抗原保存均具有良好的作用。但是,细胞蜡块切片与液基涂片的表达强度比较中,MOC-31、Napsin-A及TTF-1 3种抗体在液基涂片上的强阳性表达率比细胞蜡块切片高,且差异有统计学意义,说明液基涂片能提高不同表达部位抗体的ICC染色强度。分析原因如下:细胞蜡块技术通过4%的甲醛固定细胞,甲醛导致细胞中的蛋白变性,蛋白发生交联,导致抗原封闭,后期抗原修复不能完全暴露抗原,导致免疫染色的强度降低,同时细胞蜡块脱水过程中接触乙醇、二甲苯等有机试剂进一步引起蛋白的变性,导致抗原活性的改变,从而降低免疫染色的强度。目前,常用的抗原修复方式是热修复与化学试剂修复,常用的化学试剂修复液有EDTA、柠檬酸、EGTA、Tris、胰酶、胃酶等[14-16]。在使用相同的抗原修复液的条件下,热修复温度越高,免疫染色强度越强[17]。本研究中运用的全自动免疫组化仪采用的是微波热修复抗原,液基涂片的细胞一般呈单层平铺排列,相比于组织蜡块的3 μm切片,化学修复试剂更易充分接触细胞,微波热修复更易修复细胞抗原,从而使液基涂片的免疫染色强度更强。CK7在液基涂片与细胞蜡块切片的表达强度比较中差异无统计学意义,可能原因为CK7是日常工作中运用时间长且广泛的一种抗体,提炼纯度高、浓度高,研究表明浓度越高免疫染色越强[18]。
液基制片技术是1996年通过FDA认证的首先运用于宫颈癌筛查的一项技术,与传统的普通细胞学相比,液基保存液具有消化黏液、红细胞等作用,从而使液基涂片背景干净,提高诊断的准确性[19-22]。因此,液基涂片也被广泛运用于非妇科细胞学的诊断[23-25]。
非妇科细胞学液基制片技术是将离心后的细胞沉渣直接转运到液基保存液中,全自动液基制片机完成制片后立即将液基涂片放入95%的乙醇固定,其标准化的制片使液基涂片的细胞量丰富、细胞厚度均匀,避免了传统手工涂片细胞退变等缺点[24,26]。Dabbs等[27]运用液基涂片行ICC染色发现其染色强度强于传统普通涂片。本研究中,在液基涂片行免疫染色之前,为避免细胞掉片,行15 min 75 ℃烤片,使细胞粘附于载玻片上,余免疫染色流程与细胞蜡块切片完全相同,但是液基涂片的免疫染色结果更佳。其原因为:⑴液基涂片制作完成后立即采用95%的乙醇固定,避免细胞退变、抗原丢失,同时液基涂片细胞平铺、分散,避免了细胞蜡块切片的重叠拥挤,使抗原修复更充分,免疫染色结果更优。⑵液基保存液是多成分的复合剂,含有不同浓度的甲醇、冰醋酸、二硫化碳等[28]。研究表明免疫染色的pH值越高,免疫染色强度越强[29]。相比于4%中性甲醛固定的细胞蜡块样本,液基保存液中的冰醋酸等酸性试剂导致细胞呈弱酸性,提高免疫染色的强度。⑶液基保存液保存细胞效果优良,Sato等[30]研究表明液基保存液可以长达半年常温保存细胞抗原,因此,液基涂片有利于免疫抗原的表达。⑷液基涂片无甲醛固定,二甲苯、浸蜡等脱水步骤,减少了抗原变性与封闭的机会。
本研究中4种抗体均为即用型抗体,目前即用型抗体主要是针对组织学样本而配置。研究表明大部分组织学样本与细胞学样本免疫染色的抗体浓度相似,但是部分组织学样本抗体浓度不适合细胞学样本[27]。因此,每个实验室应该根据实际情况验证适合于细胞学样本的抗体浓度,同时需要根据不同的制片方法,验证不同的抗体浓度,使实验结果最佳。标准化的非妇科细胞学标本送检存在一定困难,细胞蜡块制作流程复杂,导致浆膜腔积液制作的细胞蜡块的细胞抗原存在一定的差异,从而导致细胞蜡块切片的免疫染色存在一定的差异。因此,标准化的细胞蜡块制作是减少免疫染色差异的方法。
虽然液基涂片的免疫染色效果优于细胞蜡块切片,但是细胞蜡块富集更多的细胞,能重复切片验证最佳的免疫染色条件,且能长年保存细胞。而液基涂片具有唯一性,不同的液基涂片的细胞可能导致免疫染色出现不同的结果,且液基保存液一般仅可制作5~8张涂片,明显少于细胞蜡块切片,不利于同一种细胞多种抗原的表达研究。因此,对于细胞蜡块切片和液基涂片的免疫染色应根据实际情况综合分析而定。若样本中肿瘤细胞量少,制作细胞蜡块困难,可以优先选择液基涂片行免疫染色,液基涂片更易观察到阳性染色结果;若胞蜡块切片免疫染色效果欠佳时,可以选择液基涂片再次重复免疫染色,更有利于明确诊断;若积液中肿瘤量多,可选择细胞蜡块切片染色,虽然细胞蜡块切片免疫染色的强度可能弱于液基制片,但染色的敏感性与液基涂片无差异,同时可组合多种抗体染色,提高诊断的准确性。
综上分析,液基涂片与细胞蜡块切片的免疫染色强度存在差异,但是细胞蜡块存储细胞量多,储存细胞条件简单,能重复多次免疫染色,液基涂片染色效果优良,但是储存细胞数量不确定。因此,液基涂片不能完全取代细胞蜡块切片,两者相结合,效果更好。实验室应根据自己的条件,验证适合细胞学样本的免疫染色条件,病理医生根据病例的具体情况选择不同载体的免疫染色,为诊断助力。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明蒋丽娟:文章撰写、酝酿和研究设计;唐福婷:采集数据、对文章的知识性内容作批评性审阅;景红霞:工作支持和指导等