鸦胆子提取物对阳春砂叶片病原真菌的抑制机理

王姗淇， 郑婉婷， 张颖颖， 张英， 何国振

（广州中医药大学中药学院，广东广州 510006）

春砂仁是产于广东阳春地区的一种道地药材，主要功效为健脾和胃[1]。随着阳春砂种植年限的延长，砂仁植株的叶片病害伴发相应严重，威胁植株的生长，影响砂仁的产量，造成经济损失[2]。因此，积极控制植株病害具有重要意义。植物会产生一些具有保护作用的次生代谢物质[3]，应用植物源农药防治中药材和果蔬病害已成为当前绿色防控的新趋势。鸦胆子为苦木科植物鸦胆子Brucea javanica（L.）Merr.的干燥成熟果实[4]，主产于我国广东、海南、广西及云南等地[5-6]，其含有油酸、苦木内酯类、黄酮类等多种化合物，具有抗癌、抗肿瘤、抗菌等多种药理作用[7]。有研究表明，鸦胆子及其叶子的提取物对薯蓣炭疽菌、意大利青霉、苹果褐腐病菌、芒果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、草莓软腐病菌、黄瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、茄子枯萎病菌和番茄枯萎病菌均具有一定的抑制作用[8-11]。

农药多通过破坏细胞膜的结构完整性，阻碍菌丝体生长，发挥抑菌作用[12]。本团队前期研究发现，鸦胆子提取物对阳春砂叶片上存在的2种病原真菌——Epicoccum thailandicum和Muyocopron laterale，有较好的抑制作用。Epicoccum属和Muyocopron属的其他真菌也可引起多种植物致病[13-14]。因此，本研究以阳春砂叶片2 种典型病原菌为研究对象，以细胞膜相关的生理生化参数为指标，探讨鸦胆子提取物的抑菌作用及机理，以期为鸦胆子开发为植物源农药提供参考，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试材与菌种鸦胆子果实购自广西百色那坡县，洗净晾干后打成中粉。引起阳春砂叶片病害的2 种真菌Epicoccum thailandicum和Muyocopron laterale由本实验室对发病植株取样后分离纯化，并经过致病性验证和菌种鉴定后获得。

1.2 试剂与仪器二喹啉甲酸（BCA）试剂盒（北京兰杰柯科技有限公司）；过氧化氢（H2O2）试剂盒（货号：A064-1-1）、丙二醛（MDA）试剂盒（货号：A003-2）、过氧化物酶（POD）试剂盒（货号：A084-3）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒（货号：A001-1-2）（南京建成生物工程研究所）。透射电镜（日立高新技术公司，HT7700 型）；生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，BPC-70F 型）；恒温培养摇床（上海一恒科学仪器有限公司，THZ-103B 型）；紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司，UV-5500PC 型）；高速冷冻离心机（THINK SCOMP®，13R型）。

1.3 鸦胆子提取物的制备参考欧阳辉桂[15]的方法调整提取条件，选择95%乙醇作为溶剂，料液比1∶7，提取温度60 ℃，提取时间2 h，提取次数3 次。合并滤液后，35 ℃减压浓缩真空干燥至恒质量，密封冷藏备用。

1.4 病原真菌内容物释放量的测定接种2 种病原菌的菌丝于马铃薯葡萄糖水培养基（PDB）中25 ℃培养72 h，无菌条件下称取2.0 g 的真菌团块若干份，分别放入50 mL 鸦胆子提取物浓度为100 mg·mL-1的无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.2）中，将此处理方法设为处理组，对照组为加入真菌团块的50 mL 无菌PBS。25 ℃下120 r·min-1（离心半径15 cm）振荡培养。分别于0、1、2、3、4、5、6、8 和10 h 取1 mL 培养液，4 000 r·min-1（离心半径8.75 cm）离心5 min，测定上清液吸光度（OD）260 nm处值，每组处理3次重复。

1.5 病原真菌菌丝体内可溶性蛋白含量的测定接种2 种病原真菌菌丝于PDB 培养基中25 ℃培养72 h，无菌条件下称取1.0 g的真菌团块若干份，分别放入20 mL 鸦胆子提取物浓度为100 mg·mL-1无菌去离子水中，将此处理方法设为处理组，对照组为加入真菌团块的20 mL 无菌去离子水。25 ℃下120 r·min-1（离心半径15 cm）振荡培养。分别在0、3、6、12、24 h 时取出菌丝，用无菌水冲洗并用灭菌滤纸吸去水分后，加入2.5 mL 预冷生理盐水中，冰浴，研磨至匀浆状，2 500 r·min-1（离心半径8.75 cm），4 ℃低温离心10 min，取上清液20 μL按照BCA 试剂盒的方法测定蛋白含量，每组重复处理3次。

1.6 病原真菌菌丝H2O2和MDA 含量的测定按照“1.5”项下方法制备样本，取上清液按照试剂盒说明书采用分光光度法测定2种病原真菌菌丝体内H2O2含量，采用比色法测定菌丝体内MDA 含量，每组处理3次重复。公式如下：

1.7 病原真菌菌丝POD和T-SOD活性的测定2种病原真菌粗酶液的制备同“1.5”项下操作，取上清液按照试剂盒说明书采用比色法测定菌丝体内POD 活性，采用羟胺法测定菌丝体内T-SOD 活性，每组处理3次重复。公式如下：

1.8 病原真菌菌丝形态的观察无菌条件下取PDB 培养基中25 ℃培养72 h 的真菌团块，放入鸦胆子提取物浓度为100 mg·mL-1的无菌水溶液中，对照组为无菌水。25 ℃下130 r·min-1（离心半径15 cm）振荡培养24 h，用无菌水冲洗去除表面的鸦胆子提取物，将处理好的样品放入3%戊二醛和1%四氧化锇中双固定，用乙醇水溶液梯度脱水，树脂包埋后切片，用醋酸铀和枸橼酸铅双染色，于透射电镜下观察。

1.9 统计方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。各组数据符合正态分布，采用配对T检验。内容物释放量因鸦胆子提取物本身带有吸光度，所以测得的数据选择与初始时刻相比较，其余指标的数据与对照组同时刻下的数据相比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鸦胆子提取物对阳春砂叶片病原真菌细胞内容物释放量的影响OD260nm值可以代表核酸的吸光度，用以指示细胞内容物的释放量。处理组培养液的OD260nm值高于对照组（见图1）。相比初始时刻，E.thailandicum的处理组在10 h 时升高了5.32倍（P＜0.001），M.laterale的处理组在1 h 时升高了98.55%（P＜0.001）。说明鸦胆子提取物使病原真菌菌丝所在溶液的OD260nm值增高，提示2 种病原真菌细胞内容物外渗。

图1 鸦胆子提取物对E.thailandicum 和M.laterale细胞内容物释放量的影响Figure 1 Effect of Brucea javanica extract on the release of cell contents of E.thailandicum and M.laterale

2.2 鸦胆子提取物对阳春砂叶片病原真菌菌丝体内可溶性蛋白浓度的影响可溶性蛋白浓度是多种生理生化指标计算的基础，蛋白质可构成多种保护酶，结合其他指标可分析菌丝体的状态。前3 h，处理组和对照组菌丝体内可溶性蛋白浓度下降（见图2），可能与菌丝更换培养体系，渗透压差改变有关。3 ～6 h，处理组菌丝体内可溶性蛋白浓度下降，根据后期透射电镜结果，推测细胞膜结构改变，可溶性蛋白外渗，使得菌丝体内蛋白浓度下降。3 h时处理组与对照组相比，E.thailandicum的处理组可溶性蛋白含量增加了3.13 倍（P＜0.001），M.laterale的处理组可溶性蛋白含量增加了1.70 倍（P＜0.001），说明病原真菌菌丝体内可溶性蛋白含量显著增加与鸦胆子提取物的刺激有关。

图2 鸦胆子提取物对E.thailandicum 和M.laterale菌丝体内可溶性蛋白浓度的影响Figure 2 Effect of Brucea javanica extract on the concentration of soluble protein in the mycelium of E.thailandicum and M.laterale

2.3 鸦胆子提取物对阳春砂叶片病原真菌H2O2和MDA 含量的影响过量的活性氧可导致包括细胞膜在内的多种细胞结构的损伤。H2O2含量是反映细胞膜过氧化程度的重要指标[16]。如图3 所示，前6 h，对照组H2O2含量出现较明显的波动，主要与病原菌的培养环境改变有关。6 h 后，处理组H2O2含量均高于对照组，E.thailandicum24 h 时升高93.30%（P＜0.001），M.laterale6 h时增加1.14倍（P＜0.01），说明鸦胆子提取物可以刺激病原真菌菌丝细胞产生过量的H2O2。

图3 鸦胆子提取物对E.thailandicum 和M.laterale过氧化氢（H2O2）含量的影响Figure 3 Effect of Brucea javanica extract on the content of hydrogen peroxide in E.thailandicum and M.laterale

MDA 是膜质过氧化过程的重要代谢产物。MDA 含量是反映细胞膜脂质过氧化程度和损伤程度的重要指标[17]。2种病原真菌的MDA含量变化趋势一致，处理组明显高于对照组（P＜0.001），见图4，说明鸦胆子提取物刺激E.thailandicum和M.laterale菌丝细胞发生了过氧化。

图4 鸦胆子提取物对E.thailandicum 和M.laterale丙二醛（MDA）含量的影响Figure 4 Effect of Brucea javanica extract on the malondialdehyde（MDA）content of mycelium of E.thailandicum and M.laterale

2.4 鸦胆子提取物对阳春砂叶片病原真菌POD 和T-SOD 活性的影响POD 和T-SOD 是细胞过氧化的保护酶，其活性的变化可以反映细胞的过氧化过程[18]。由图5 可见：2 种病原真菌对照组的POD含量整体呈上升趋势，可起到消除过氧化产物的作用，保护细胞；E.thailandicum处理组的POD 活性呈下降趋势，12 h 后POD 活性趋近于零。M.laterale的POD 始终趋于零活性，M.laterale的POD活性相比对照组均显著降低（P＜0.001），提示POD可能受到鸦胆子提取物干扰而失活。

图5 鸦胆子提取物对E.thailandicum 和M.laterale过氧化物酶（POD）活性的影响Figure 5 Effect of Brucea javanica extract on the peroxidase（POD）activity of E.thailandicum and M.laterale

相比于POD，T-SOD 受鸦胆子提取物影响程度稍轻。与对照组相比，处理组E.thailandicum3 h时酶活性降低60.38%（P＜0.001），M.laterale12 h时酶活性降低79.61%（P＜0.001），见图6。24 h内，处理组酶活性始终呈现出低于对照组的现象，说明在鸦胆子提取物的作用下，病原真菌的TSOD 活性无法达到抵御细胞过氧化的正常水平。鸦胆子提取物降低了病原真菌的POD 和T-SOD 的活性，从而使其菌丝细胞因过氧化而造成损伤。

图6 鸦胆子提取物对E.thailandicum 和M.laterale总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性的影响Figure 6 Effect of Brucea javanica extract on the total superoxide dismutase（T-SOD）activity of E.thailandicum and M.laterale

2.5 鸦胆子提取物对阳春砂叶片病原真菌菌丝形态的影响细胞是菌丝的基本单元，破坏其结构将导致细胞内容物外渗，进一步影响菌丝的正常生理活动[19]。由图7 可见，对照组细胞结构完整，细胞壁和细胞膜边缘清晰，细胞间质均匀。经过鸦胆子提取物处理后，该2种病原真菌细胞膜出现不同程度的缺损或粗糙，细胞内空腔增多，E.thailandicum出现核质浓缩，M.laterale出现核碎裂。说明鸦胆子提取物可以透过并损坏病原真菌细胞膜。

图7 鸦胆子提取物对E.thailandicum 和M.laterale菌丝形态的影响（×6 000）Figure 7 Effect of Brucea javanica extract on mycelial morphology of E.thailandicum and M.laterale（×6 000）

3 讨论

附球菌属（Epicoccumsp.）和Muyocopronsp.的真菌可引起多种植物致病，尤其是前者，附球菌属的真菌在全球20个国家中危害多种植物的健康[13]。鸦胆子提取物可抑制这2 个属中的病原真菌——Epicoccum thailandicum和Muyocopron laterale，在果蔬和中药材种植过程中具有开发为植物源农药的潜能。

本研究中，真菌内容物释放量的测定显示，鸦胆子提取物可以增加2 种病菌细胞膜的通透性。考察这2 种病原真菌菌丝体内H2O2和MDA 含量的变化，表明细胞膜通透性的改变可能与膜脂质过氧化相关。研究[20-22]表明，一旦打破细胞膜脂质过氧化和氧自由基反应的动态平衡即可损伤细胞膜，增加细胞膜通透性，造成细胞损伤。进一步采用透射电镜观察鸦胆子提取物对2种病原真菌细胞膜结构的影响，表明处理后的病原真菌细胞结构受损，细胞内空腔增多。综上所述，鸦胆子提取物可通过降低过氧化作用相关的保护酶活性，使得2种病菌细胞中过量的活性氧无法及时消除，进而发生脂质过氧化，造成细胞膜通透性增加，细胞内容物外渗，从而达到抑制菌丝生长的效果。

本研究主要集中在鸦胆子提取物对E.thailandicum和M.laterale细胞膜的通透性及细胞过氧化的影响方面。后续鸦胆子提取物抑制病原菌的机制研究有待进一步运用组学分析，例如基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学以及多个组学联合应用，并深入探讨鸦胆子提取物是否影响DNA 复制、RNA 水平、转运蛋白活性、糖基化过程等，以期更好地理解病原菌的细胞功能、生长、发育和生物系统构建及遗传互作[23]。