Vero 细胞生长过程中葡萄糖消耗量与细胞数量关系的研究

简伟，刘永连，张瑞，郭林，肖海峰，李国顺

（北京民海生物科技有限公司/北京市新型联合疫苗工程技术研究中心，北京 102600）

贴壁细胞培养的放大方式包括从方瓶或平皿放大至转瓶、多层方瓶或细胞工厂，这些培养方式均为低密度细胞培养，放大能力只能依靠增加培养单元的数量来提高[1-2]。因此，无论是贴壁培养工艺还是悬浮培养工艺，生物反应器工艺是大规模培养细胞和病毒最适合的选择[3]。固定床生物反应器片状载体工艺在病毒性疫苗领域已得到广泛应用，具有剪切力低、换液快、可大规模连续灌流培养等优势[4]。但由于不能实时取样难以对细胞进行消化计数，从而难以准确检测细胞密度、判断细胞生长速度，对于需严格按病毒感染复数（MOI）接毒的病毒培养工艺也造成一定的困扰[5]。本实验建立了一种简单快捷应用于固定床生物反应器（片状载体）的细胞计数方法，为片状载体细胞培养工艺的细胞计数提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞

Vero 细胞142 代，由北京民海生物科技有限公司研发中心保存。

1.2 试剂及耗材

Gibco OptiPRO SFM 培养基、基因重组胰酶，美国Thermo Fisher Scientific 公司；Cedex Bio 配套葡萄糖检测试剂盒，瑞士Hoffmann-La Roche 公司；片状载体，上海楚鲲生物科技有限公司。

75 cm2细胞培养瓶（T75）、225 cm2细胞培养瓶（T225）、2 层细胞工厂（CF2）、10 层细胞工厂（CF10），丹麦Corning 公司。

1.3 设备

MCO-20AIC 型二氧化碳培养箱，日本Panasonic公司；CKX53 型倒置显微镜，日本OLYMPUS 公司；IC1000 型细胞计数仪，上海睿钰生物科技有限公司；Cedex Bio 型生化分析仪，瑞士Hoffmann-La Roche 公司；Cellipower 09-5L 型生物反应器，上海戈洛思生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞复苏和传代

（1）复苏。取1 支Vero 细胞（代次142），在（39±1）℃水浴快速化冻后接入T75 细胞培养瓶中，缓慢补加细胞培养液至30 mL，置于37.0 ℃、5% CO2的培养箱内培养3 d。

（2）传代。将1 个T75 按照1 ∶6 的传代比例，传2 个T225，置于37.0 ℃、5% CO2的培养箱内培养3 d，此时的细胞代次为144。取1 个144 代的T225按照1 ∶6 的传代比例，传6 个T225，置于37.0 ℃、5% CO2的培养箱内培养3 d，此时的细胞代次为145。取1 个145 代的T225 按照1 ∶6 的传代比例，传1 个CF2，置于37.0 ℃、5% CO2的培养箱内培养3 d，此时的细胞代次为146。

（3）传代比例控制。取146 代细胞消化后的细胞悬液，按照1 ∶4（7.5×104个/cm2）、1 ∶6（5×104个/cm2）、1 ∶8（3.75×104个/cm2）的接种密度接种至T75 细胞培养瓶，每个密度接种16 瓶，置于5% CO2培养箱内（37±1）℃进行培养。

1.4.2 葡萄糖含量检测及细胞计数

分别于24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 取3 瓶不同传代比例细胞的上清液检测葡萄糖含量，并消化细胞，取20 μL 细胞悬液用细胞计数仪计数，记录培养上清液葡萄糖含量和细胞密度。

1.4.3 统计方法

以培养时间为X 轴，细胞数量为Y 轴，绘制不同传代比例的细胞生长曲线。使用Excel 2010 软件，以葡萄糖累计消耗量为X 轴，以细胞数量为Y 轴作散点图，添加线性趋势线，得到葡萄糖消耗与细胞数量关系方程。

1.4.4 葡萄糖消耗和细胞数量关系在生物反应器上的应用

从反应器中每天取培养上清液，用生化分析仪检测其葡萄糖含量，再结合灌流量、上一次测得的培养上清液的葡萄糖含量，按照公式（1）计算出葡萄糖消耗量，将累计消耗的葡萄糖量代入葡萄糖消耗量与细胞数量关系方程，即可得到反应器内细胞总量。以培养时间为X轴，反应器内细胞总数为Y轴作生长曲线，分析Vero 细胞的生长规律。

其中，M为葡萄糖消耗量，M1为上次取样测得的葡萄糖浓度，M2为灌流培养液葡萄糖浓度，M3为本次取样测得的葡萄糖浓度，V1为生物反应器培养体积，V2为灌流体积。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖消耗与细胞数量关系的确定

不同传代比例的细胞生长曲线见图1。从生长曲线上看，3 种传代比例细胞均呈现S 型的生长趋势，延迟期、对数生长期和平台期初期时间基本一致，所选传代比例对细胞生长影响不大。

图1 Vero 细胞生长曲线

设置截距为0，1 ∶4、1 ∶6 和1 ∶8 传代比例的葡萄糖消耗量与细胞数量的线性方程分别如图2 所示，R2分别为0.966 1、0.983 3、0.969 1。葡萄糖消耗量与细胞数量基本呈线性关系，且呈现传代比例越小斜率越大的规律；取3 个斜率的平均值4.107×108作为葡萄糖消耗量与细胞数量线性方程的系数，即每消耗1 g 葡萄糖对应的细胞收获量为4.107×108个，与文献[6]报道的每消耗1 g 葡萄糖对应5.345×108个细胞非常接近。

图2 葡萄糖消耗量与细胞数量关系

2.2 葡萄糖消耗量与细胞数量关系在反应器上的应用

Vero 细胞进行反应器培养，从图3 所示的生长曲线可以发现，0 ～2 d 细胞生长缓慢，为停滞期；2 ～6 d 细胞进入对数生长期，葡萄糖消耗量不断增加；5 ～6 d 达到最高峰，而后处于平台期。

图3 生物反应器内Vero 细胞生长曲线

3 结论与讨论

片状载体和微载体细胞培养是最主流的贴壁细胞培养工艺，而片状载体相对于微载体培养，具有可以得到更高的细胞收获量、灌流速度和换液操作可在很短的时间内完成、不会对细胞造成影响等优点，被广泛应用于病毒疫苗生产领域[7]。如杨屹等[8]应用片状载体生产的Vero 细胞密度高达1.0×107个/mL，收获的病毒液毒力达7.5×106～3.4×108FFU/mL；刘岩松等[9]使用篮式生物反应器制备森林脑炎灭活疫苗（Vero 细胞），获得细胞密度1.04×107个/mL，病毒收获液平均滴度8.4 lg LD50/mL。

但片状载体工艺存在无法将载体取出进行计数的缺点[7]，对于片状载体细胞计数方法的文献报道较少。周蕾等[6]使用培养瓶培养的细胞，先建立Vero细胞浓度与电容的线性关系，然后检测生物反应器内电容，通过电容值和线性方程算出细胞密度。基于此，本文建立了葡萄糖消耗量与Vero 细胞数量的计算方法，即每消耗1 g 葡萄糖对应的细胞数量为4.107×108个，在Cellipower 09-5L 反应器内细胞生长6 d 累计消耗葡萄糖71.28 g，所获得细胞数量为2.93×1010个，为生物反应器片状载体细胞培养工艺细胞计数提供了一种方法。