基于AFLP分子标记的鸭绿江茴鱼遗传多样性分析

闫春梅 高春山 郑伟 王秀兰 刘长有 金香琴

(吉林省水产科学研究院,吉林长春 130033)

鸭绿江茴鱼(Thymallusarcticusyaluensis)隶属于鲑形目、茴鱼科,主要分布于吉林省鸭绿江流域,分布区域狭小,群体间不存在地理隔离[1]。该鱼肉质细嫩,营养丰富,经济价值极高,是优质名贵珍稀鱼类。受诸多因素影响,近年来鸭绿江茴鱼资源严重衰退,已被列为国家Ⅱ级保护动物[2]。自2013年开始,孙锴等[3]、王秀兰等[4]、曹永芬等[5]分别在鸭绿江茴鱼人工繁殖及成鱼养殖方面进行了科学研究,突破了鸭绿江茴鱼人工养殖的技术瓶颈。马波等[6]、刘云国等[7]和Sun等[8]相继应用线粒体D-loop基因序列分析法和微卫星标记法对茴鱼群体结构进行了系统分析,更加精确地分析了茴鱼的群体遗传结构,为茴鱼种质资源分析及保护夯实了基础,也为茴鱼人工增殖放流提供了科学依据。但关于鸭绿江茴鱼群体遗传多样性及遗传结构研究至今鲜有报道。

本研究将扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)方法应用于鸭绿江茴鱼群体遗传多样性研究中,利用AFLP标记高度的灵敏性、较好的重复性和丰富的信息量等优势,分析并探讨鸭绿江茴鱼群体遗传结构及群体种质资源现状,以支持鸭绿江茴鱼资源可持续利用研究的稳步开展,为资源的长期开发利用提供重要的数据资料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用鸭绿江茴鱼采捕自吉林省内各江段,其中鸭绿江上游采捕48尾,松花江上游采捕24尾;临江金鲨养殖场采集18尾,共计90尾。

PCR相关试剂购自TaKaRa公司;引物、AFLP试剂盒、DNA提取试剂盒及其他试剂均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 DNA提取

DNA提取按照离心柱型动物组织基因组DNA提取试剂盒的方法进行。提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度后,于4 ℃保存备用。

1.3 AFLP分析

参照AFLP试剂盒的说明方法进行AFLP反应,并适当优化反应条件。

1.3.1 酶切连接

采用一步法进行酶切连接反应,接头引物序列详见表1。具体反应体系(20 μL)如下:10×Reaction buffer 2.5 μL,10 mmol/L ATP 2.5 μL,Adapter 1 μL,EcoR I/MseI 2 μL,T4 Ligase 1 μL,模板DNA 4 μL(50 ng/μL),AFLP-Water 7 μL。混匀后瞬时离心,37 ℃ 5 h,8 ℃ 4 h,4 ℃保存过夜。

表1 AFLP接头及预扩增引物序列

1.3.2 预扩增

预扩增采用25 μL反应体系,具体配比如下:10× PCR buffer 2.5 μL,预扩增引物(EcoR I/MseI 50 ng/μL等比混合)1 μL,dNTPs 1 μL,TaqDNA polymerase(2 U/μL) 0.5 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 18 μL。混合均匀后瞬时离心,94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s,30个循环;72 ℃延伸5 min。

1.3.3 选择性扩增

以预扩增产物1∶20稀释后作为选扩模板。选择性扩增为25 μL反应体系,具体配比如下:10× PCR buffer 2.5 μL,EcoR I 引物(共8种) 1 μL,MseI 引物(共8种) 1 μL,dNTPs 0.5 μL,TaqDNA polymerase 0.5 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 17.5 μL。混匀后瞬时离心。94 ℃变性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s,以后每轮循环温度递减0.7 ℃,扩增12轮。接着按94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸80 s扩增23轮。选择性扩增引物序列见表2。

表2 选择性扩增引物序列

1.3.4 AFLP图谱分析

AFLP多态性分析采用ABI 377测序仪进行。

1.4 数据分析

利用GENESCAN 3.1提取数据,利用Binthere软件提取样品片段大小。利用Excel软件进行数据统计01矩阵处理,将不为0的数值转换为1,数值0不变,生成由0和1组成的原始矩阵。利用Popgen 32软件分析位点总数、多态性位点、多态性位点频率、观测等位基因数、有效等位基因数、Nei’s多样性指数、Shannon’s信息指数等遗传学数据。利用NTSYSpc-2.11F软件对原始矩阵求DICE相似系数矩阵。用SHAN程序中的UPGMA方法进行聚类分析,并通过Tree plot模块生成聚类图。

2 结果

2.1 AFLP选择性扩增结果

筛选多态性好且条带清晰的EcoR I和MseI引物组合8对,对90尾茴鱼进行了AFLP分析,结果见表3。8组引物共扩增出2 670个位点,其中多态性位点2 466个,多态性位点比例为92.4%。其中,引物组合E10M6多态性位点比例最高,达到99.4%;引物组合E3M7多态性比例最低,为84.0%。

表3 8组引物的多态性分析

2.2 遗传多样性分析

利用Popgen 32软件分析3个群体90尾鸭绿江茴鱼的遗传多样性,结果见表4。其中E10M6引物组合的各项参数值均最高,观测等位基因数(Na)为1.708 3,有效等位基因数(Ne)为1.257 0,Nei’s多样性指数(H)为0.160 4,Shannon’s信息指数(I)为0.256 2。3个群体比较,鸭绿江上游群体的各项参数值均最高,Na为1.340 9,Ne为1.153 8;H为0.093 2,I为0.144 7;临江群体次之,松花江上游群体各项参数值均最低。

利用Popgen 32软件分析3个茴鱼群体的遗传分化情况,结果见表5。8对引物组合的遗传分化系数(Gst)为0.176 7～0.254 7,其中E10M6值最大,E6M5值最小,表明8对引物组合在3个群体间的遗传分化占总群体杂合度的17.67%～25.47%。3个群体的平均Gst值为0.219 4,表明3个群体间发生了一定程度的分化。其中,松花江上游群体与临江群体间平均Gst值为0.232 2,松花江上游群体与鸭绿江上游群体间平均Gst值为0.186 6,鸭绿江上游群体与临江群体间平均Gst值为0.094 3,可见任意两个群体间均发生了中等程度以上的遗传分化。

表5 3个鸭绿江茴鱼群体间的遗传分化系数

通过分析DICE相似系数矩阵,90尾茴鱼的遗传相似性为0.820 6～0.936 3。其中,3个群体内遗传相似性分别为:鸭绿江上游群体0.832 2～0.936 3,平均0.895 9;松花江上游群体0.879 6～0.931 7,平均0.900 9;临江群体0.855 3～0.910 3,平均0.881 6。利用8对引物对3个鸭绿江茴鱼群体进行UPGMA聚类分析,结果显示,3个茴鱼群体中,松花江上游群体单独聚为一支,鸭绿江上游群体和临江群体出现聚群情况。

图1 3个鸭绿江茴鱼群体系统进化树

3 讨论

遗传多样性(genetic diversity)又称基因多样性,是指种内基因的变化,包括种内显著不同的种群间和同一种群内的遗传变异。AFLP是一种基于PCR反应选择性地扩增限制片段的方法,根据特异片段或多态位点的频率或遗传相似性可进行遗传多样性及遗传分化等研究。本研究主要是对吉林省鸭绿江茴鱼群体进行种群内的遗传变异分析。从多肽位点比例(PPL)、观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s多样性指数(H)、Shannon’s信息指数(I)、总群体杂合度(Ht)、亚群体杂合度(Hs)、遗传分化系数(Gst)和群体遗传相似性等几个遗传多样性分析常用指标,对分别采捕(采集)自鸭绿江上游、松花江上游以及临江金鲨养殖场的共计90尾鸭绿江茴鱼的鳍条样本进行了AFLP遗传多样性分析。

3.1 鸭绿江茴鱼遗传多样性水平分析

鸭绿江茴鱼分布于鸭绿江上游及其支流水系中,其分类学地位一直存有争议[1]。2011年,孙家贤等[9]对黑龙江茴鱼、下游黑龙江茴鱼及黑龙江上游呼玛河流域北极茴鱼等3种茴鱼的遗传多样性进行了微卫星比较分析,确定3种茴鱼遗传多样性水平很高,种间产生了显著的遗传分化,并支持3种茴鱼在属内各为独立种的分类学地位。Koskinen等[10]、Stamford等[11]利用微卫星分子标记和mtDNA-RFLP标记分别研究了欧洲和美洲不同茴鱼群体的地理遗传结构及亲缘关系。Froufe等[12]、Weiss等[13]和马波等[6]利用线粒体D-loop区DNA序列分析了不同茴鱼群体的分子进化关系。但关于鸭绿江茴鱼遗传多样性水平的分析研究国内尚未见相关报道。大规模的群体遗传分析是更好地保护茴鱼群体资源的重要手段和方法。本研究利用AFLP方法,对吉林省内鸭绿江茴鱼3个群体进行了遗传多样性水平分析,共筛选出8组多态性好且条带清晰的引物,对90尾茴鱼DNA样本进行PCR扩增,总计扩增出2 670个位点,其中多态性位点2 466个,多态性位点的比例高达92.4%,显著高于福建近海竹荚鱼闽东和闽南群体(63.28%、61.89%)[14]及广东省吉富罗非鱼群体(87.17%)[15],可见本研究中90尾鸭绿江茴鱼遗传多态性较高。究其原因,可能是本研究采集的鸭绿江茴鱼大多数来自野生环境,且采自不同地域,这也表明吉林省内茴鱼种质资源质量较好。

本研究对3个鸭绿江茴鱼群体进行了遗传结构及遗传变异分析,Na、Ne、H、I这4个指标的结果显示,鸭绿江上游群体各项值均最高,分别为1.340 9、1.153 8、0.093 2、0.144 7;临江群体次之,松花江上游群体各项值最低。筛选出8组引物对3个群体的90尾鸭绿江茴鱼进行PCR扩增,计算结果,Na为1.251 7～1.340 9,Ne为1.130 0～1.153 8,H为0.078 2～0.093 2,I为0.119 8～0.144 7,这与吉林省杂色杜父鱼野生群体的测量值相当(Na为1.203 7～1.316 6,Ne为1.111 9～1.151 7,H为0.067 0～0.091 2,I为0.102 0～0.141 0)[16],而略低于翘嘴红鲌太湖野生群体(Na为1.579 9,Ne为1.385 9,I为0.322 1)[17],可见本研究采集的90尾鸭绿江茴鱼个体间存在一定的遗传变异,对环境的适应性为中等。

3.2 鸭绿江茴鱼遗传结构分析

遗传分化系数度量的是群体间的基因多样性。Wright[18]认为,当群体之间的遗传分化处于中等程度时,遗传分化系数通常在0.05～0.15。本研究利用Ht、Ns及Gst指标值对3个鸭绿江茴鱼群体的遗传分化情况进行分析,Gst平均值为0.219 4,这与条斑星鲽引进群体的Gst值相近(0.219)[19],而高于福建近海竹荚鱼闽东和闽南群体(0.044 3)[14]。表明本研究3个鸭绿江茴鱼群体之间的遗传分化程度很高。

遗传相似性及UPGMA聚类分析结果显示,3个群体90尾鸭绿江茴鱼个体的遗传相似性较高,为0.820 6～0.936 3,遗传距离较小。通过系统进化树明显看出,松花江上游群体单独聚为一支,鸭绿江上游群体和临江群体聚为一支,表明3个群体间出现了较高程度的分化,这与遗传分化系数显示的结果相一致。