UPLC 法同时测定养阴清肺丸中7 种成分

2023-09-19尹丽华陈安珍殷世宁吴爱英卢京光

中成药 2023年9期

袁航，尹丽华，陈安珍，殷世宁，吴爱英，卢京光

（青岛市食品药品检验研究院，国家药品监督管理局海洋中药质量研究与评价重点实验室，山东青岛 266071）

养阴清肺丸由地黄、麦冬、玄参、川贝母、白芍、牡丹皮、甘草、薄荷8 味药材组成，具有养阴润燥、清肺利咽的功效，临床上用于治疗阴虚肺燥、咽喉干痛、干咳少痰或痰中带血，现收载于2020 年版《中国药典》一部，有大蜜丸、小蜜丸、水蜜丸、水丸4 种规格［1］，但仅对丹皮酚进行控制，而且目前相关文献也仅涉及芍药苷［2-4］。中药复方制剂药味众多，组成复杂，仅以单一成分为指标无法实现全面客观评价其质量的目的［5-7］，故本实验采用UPLC 法同时测定养阴清肺丸中哈巴苷、芍药苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸的含量，以期为提高该制剂质量控制标准提供理论依据、技术支撑。

1 材料

Agilent 1290 Infinity 快速高分离液相色谱仪（美国Agilent 公司）；ME204T／02 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AS10200BT 型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。哈巴苷（批号111729-201707，纯度96.8%）、芍药苷（批号110736-201943，纯度 100%）、甘草苷（批号111610-201908，纯度95.0%）、毛蕊花糖苷（批号111530-201914，纯度95.2%）、哈巴俄苷（批号111730-201709，纯度95.9%）、丹皮酚（批号110708-201407，纯度99.9%）、甘草酸铵（批号110731-201720，纯度97.7%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。养阴清肺丸共96 批，由14个厂家生产，其中3 个厂家生产水蜜丸，共46 批；12 个厂家生产大蜜丸，共46 批；1 个厂家生产小蜜丸，共3 批；1 个厂家生产水丸，共1 批（由于1 个厂家同时生产大蜜丸、水蜜丸，1 个厂家同时生产大蜜丸、水丸，1 个厂家同时生产大蜜丸、小蜜丸，故有交叉现象）。乙腈为色谱纯（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；其余试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件、系统适用性考察 Agilent SB-C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～3 min，3% A；3～16 min，3%～16%A；16～20 min，16%A；20～26 min，16%～25% A；26～31 min，25%～30% A；31～33 min，30%～37%A；33～38 min，37%～42%A；38～40 min，42%～45%A；40～45 min，45%～100%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长210 nm （0～8 min，哈巴苷）、230 nm （8～18 min，芍药苷）、278 nm （18～21 min，甘草苷）、332 nm （21～27 min，毛蕊花糖苷）、278 nm（27～33 min，哈巴俄苷、丹皮酚）、252 nm （33～45 min，甘草酸铵）；进样量4 μL。

2.2 对照品溶液制备精密称取哈巴苷、芍药苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸铵对照品适量，70%甲醇制成每1 mL 分别含435、883.75、255、135、146、1 036.67、711 μg 上述成分的贮备液，分别精密吸取适量，70%甲醇制成适宜质量浓度，即得（甘草酸含量＝甘草酸铵含量／1.020 7）。

2.3 供试品溶液制备取本品（水蜜丸或水丸）适量，研成细粉，取约1.5 g，精密称定；另取重量差异项下的大蜜丸或装量差异项下的小蜜丸，剪碎，取约2.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声（功率250 W，频率33 kHz）处理30 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备按本品处方比例，分别制成缺白芍和牡丹皮、缺地黄和玄参、缺甘草、缺玄参、缺白芍的阴性样品，按“2.3” 项下方法制备，即得。

2.5 专属性试验取对照品、供试品、阴性样品溶液各4 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，阴性样品在与对照品色谱峰相应位置处无吸收峰，表明其他成分对测定结果无影响，该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig．1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 线性关系考察精密吸取“2.2” 项下贮备液适量，甲醇逐级稀释成5 个质量浓度，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，并分别以信噪比S／N＝3、S／N＝10 时的质量浓度为检出限、定量限，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab．1 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度试验取对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得哈巴苷、芍药苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸峰面积RSD 分别为1.48%、0.14%、0.27%、0.17%、0.26%、0.16%、0.15%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验取水蜜丸（批号17035288）、大蜜丸（批号18010541）适量，按“ 2.3” 项下方法分别制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得水蜜丸中哈巴苷、芍药苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸含量 RSD 分别为 1.10%、1.51%、0.65%、0.77%、0.49%、0.98%、0.51%，大蜜丸中其含量RSD 分别为1.60%、1.69%、0.94%、0.51%、0.30%、0.75%、0.12%，表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验取“2.8” 项下水蜜丸、大蜜丸供试品溶液各1 份，于0、2、8、10、12、24 h在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得水蜜丸中哈巴苷、芍药苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸峰面积RSD 分别为1.05%、0.59%、0.97%、1.01%、1.14%、0.48%、0.55%，大蜜丸中其峰面积RSD 分别为1.41%、0.86%、0.99%、1.03%、1.47%、0.83%、0.64%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验

2.10.1 水蜜丸取粉碎后的本品（批号17035288）约0.75 g，精密称定，精密加入对照品溶液（未稀释）适量，按“2.3” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，哈巴苷、芍药苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸平均加样回收率分别为 103.05%、103.51%、100.61%、97.81%、101.06%、95.67%、101.40%，RSD 分别为 1.94%、2.14%、2.92%、1.45%、1.17%、1.83%、1.46%。

2.10.2 大蜜丸取剪碎的本品（批号18010541）约1.25 g，精密称定，精密加入对照品溶液（未稀释）适量，按“2.3” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，哈巴苷、芍药苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸平均加样回收率分别为 103.46%、104.24%、100.17%、95.97%、102.65%、95.41%、101.31%，RSD 分别为0.83%、1.97%、2.62%、0.76%、2.43%、2.33%、2.35%。

2.11 样品含量测定取46 批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果（mg／g）Tab．2 Results of content determination of various constituents （mg／g）

3 讨论

本实验发现，哈巴苷、哈巴俄苷、芍药苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚、甘草苷最大吸收波长分别为210、282、230、332、274、278、252 nm，由于要使每种成分都处在最佳检测波长下，故采用分段变换波长法。另外，丹皮酚、哈巴俄苷色谱峰保留时间、最大吸收波长相近，故在278 nm 处对两者进行检测。

前期报道，哈巴苷、哈巴俄苷归属于玄参，芍药苷归属于白芍、牡丹皮［8］，丹皮酚归属于牡丹皮，毛蕊花糖苷归属于地黄［9］、玄参［10］，甘草苷、甘草酸归属于甘草。本实验发现，投料质量较差的药味主要涉及玄参、地黄，1 家企业全部3 批大蜜丸均未检测出哈巴苷、哈巴俄苷，其中1 批未检出毛蕊花糖苷，1 批含量较低，仅1 批含量处于中上游水平，提示该厂家应关注上述2 种药材的投料风险；1 家企业全部3 批样品均未检出哈巴苷，并且哈巴俄苷含量均较低，而毛蕊花糖苷含量均处于正常水平，研究表明，不同产地玄参中哈巴苷、哈巴俄苷含量差异较大，大多数是前者高于后者，也有少数恰好相反［11-13］，提示该厂家需关注该药材投料风险。

甘草中黄酮类（如甘草苷等）、三萜类（如甘草酸等）化合物含量较高，为该药材主要药效成分［14］。研究表明，甘草中甘草苷、甘草酸含量与基原［15-16］、产地［17］、生长年限［18］相关，而本实验中不同企业或同一企业不同批次样品中两者含量差异较大，与上述文献报道一致。另外，1 家企业5批水蜜丸中甘草苷含量均处于较低水平，12 批样品中甘草酸含量亦然，提示该厂家在后续生产中应关注该药材质量风险。